解毒通絡方中三七皂苷類成分腦脊液藥代動力學研究

李 磊，張麗慧，李 智，周曉耘，辛文鋒，張文生

(1.北京師范大學地表過程與資源生態國家重點實驗室北京 100875;2.北京中醫藥大學北京 100029;3.北京師范大學校醫院北京 100875;4.中藥資源保護與利用北京市重點實驗室北京 100875)

三七皂苷類成分是中藥三七的主要有效成分，現代藥理學研究發現三七皂苷在心腦血管系統、神經系統、血液系統、物質代謝以及抗炎、抗腫瘤等方面均有較好活性［1］，三七皂苷所具有的這些功效使其在治療腦源性疾病方面具有廣闊的應用前景。解毒通絡方是王永炎院士的臨床經驗方，由梔子有效部位、三七總皂苷以及燈盞花有效部位組成，具有祛瘀、清熱、解毒的功效，主要用于治療缺血性中風病。本文以人參皂苷Rg1及三七皂苷R1為指標成分，采用HPLC-MS/MS法測定靜脈注射給藥后人參皂苷Rg1及三七皂苷R1在大鼠腦脊液的動力學變化規律，同時研究解毒通絡方(Jiedutongluo prescription，JDTL)復方配伍對人參皂苷Rg1及三七皂苷R1在大鼠腦脊液中分布的影響。

1 材料

1.1 藥品與試劑 三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為:110745-200415、110703-200726);三七總皂苷、解毒通絡方(北京師范大學中藥資源與資源藥物研究所提供);甲醇(色譜純，美國Fisher公司)。1.2 儀器 Q-TRAP 3200質譜儀(Analyst 1.4.2數據處理軟件，美國Applied Biosystem公司);Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.3 動物 Wistar大鼠，♂，體質量(220±20)g，清潔級，購自中國醫學科學院協和動物研究所。許可證號 SCXK(京)2005－0013。實驗前禁食過夜，飲水不限。

2 方法

2.1 給藥與采樣 取大鼠6只，隨機分成三七總皂苷給藥組和解毒通絡方給藥組，每組3只。腹腔注射6 ml·kg－1(10 g·L－1)的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，剪開大鼠頭頸部背側皮膚，鈍性剝離覆蓋在枕骨上的肌肉，將連有PE管的針頭刺入枕骨大孔，使腦脊液能順著PE管流出。用膠黏劑以及牙科水泥固定針頭并用夾子夾住PE管尾端。采集樣品時取下夾子，用微量注射器緩慢抽取，采樣完畢后，再用夾子夾住 PE 管末端［2］。

根據解毒通絡方的處方量，按三七總皂苷(PNS)16.8 mg·kg－1(其中三七皂苷 R1的含量為8.4%，人參皂苷 Rg1的含量為21.8%)、解毒通絡方(JDTL)22.2 mg·kg－1的劑量尾靜脈注射分別給予三七總皂苷生理鹽水溶液和解毒通絡方生理鹽水溶液，于給藥后不同時間點(5、10、20、40、60、90、120、180、240、480 min)采集腦脊液 20 μl，置于－80℃冰箱保存備用。

2.2 腦脊液樣品預處理 取腦脊液樣品15 μl，加入甲醇 45 μl，渦旋振蕩 1 min，離心 10 min(10 000 r·min－1)后取上清液，進樣。

2.3 分析方法 液相色譜條件:色譜柱:Symmetry ShieldTMRP18(5 μm，4.6 mm ×150 mm);流動相:A為甲醇，B為水，梯度洗脫程序見Tab 1;流速:1.0 ml·min－1;進樣量:20 μl;柱溫:25℃ 。

質譜條件:掃描方式:多重反應監測(MRM);離子源:離子噴霧離子化源;離子噴射電壓:5500 V;檢測方式:正離子方式，人參皂苷 Rg1［M+Na］+(823.5/643.6)，解簇電壓130 V，碰撞能量50 eV;三七皂苷 R1［M+Na］+(955.3/203.2)，解簇電壓140 V，碰撞能量66 eV。

Tab 1 Gradient program of determination of notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1in rat cerebrospinal fluid by HPLC-MS

2.4 質控樣品的制備 取空白腦脊液，加入三七皂苷R1和人參皂苷 Rg1的對照品溶液，配制成低、中、高3個濃度的腦脊液樣品(三七皂苷 R1的濃度為25，100，400 μg·L－1;人參皂苷 Rg1的濃度為50，200，800 μg·L－1)，按照“2.2”方法操作后進樣。

2.5 標準曲線繪制 精密稱取三七皂苷 R1和人參皂苷Rg1對照品適量，置25 ml量瓶中，用甲醇配制成一定濃度的混合對照品儲備液，臨用時，用空白腦脊液稀釋至標準系列濃度的對照品混合溶液，三七皂苷 R1的濃度分別為 2.5、5、12.5、25、62.5、125、250、500 μg·L－1，人參皂苷 Rg1的濃度分別為5、10、25、50、125、250、500、1 000 μg· L－1。按“2.2”方法操作并進樣測定，以各對照品色譜峰峰面積 Y為縱坐標，對照品濃度X(μg·L－1)為橫坐標，采用加權(權重1/X2)最小二乘法進行線性回歸。

2.6 含藥腦脊液樣品測定 三七總皂苷單獨給藥組和解毒通絡方給藥組的大鼠腦脊液樣品的處理方法同“2.2”。樣品測定方法同“2.3”。

2.7 數據處理 實驗數據用DAS 2.0版藥動學軟件擬合計算各項藥動學參數。

3 結果

3.1 方法專屬性 在采用的色譜和質譜條件下，三七皂苷R1和人參皂苷 Rg1的全掃描質譜圖見Fig 1，樣品測定結果見Fig 2、3。三七皂苷 R1和人參皂苷Rg1分離良好，腦脊液中的內源性物質不干擾三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的測定。

Fig 1 Full-scan mass of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1

Fig 2 MRM of notoginsenoside R1in rat CSF determination by HPLC-MS

3.2 標準曲線與線性范圍 三七皂苷R1的標準曲線:=153X+157(r=0.998 1，n=8)，線性范圍為2.5 ～500 μg·L－1;人參皂苷 Rg1的標準曲線:=477X+454(r=0.993 4，n=8)，線性范圍為 5～1 000 μg·L－1。三七皂苷 R1和人參皂苷 Rg1最低定量限分別為 2.5、5 μg·L－1。

3.3 精密度試驗 取低、中、高3個濃度的質量控制樣品，按“2.2”方法操作，進樣測定，每個濃度樣品連續進樣3次，計算樣品濃度，測定日內精密度。每個濃度的樣品連續3 d，每天進樣，測定日間精密度。測定結果三七皂苷R1和人參皂苷 Rg1的日內精密度RSD均小于5%、日間精密度RSD均小于12.2%，見 Tab 2。

3.4 回收率實驗 取低、中、高3個濃度的質控樣品進行測定，每個濃度平行操作3份，用標準曲線求得實際濃度，與理論濃度相比得到方法回收率。三七皂苷R1和人參皂苷 Rg1的平均回收率分別為98.0% ～102.7%、93.9% ～101.1%，見Tab 3。

Fig 3 MRM of ginsenoside Rg1in rat CSF determination by HPLC-MS

Tab 2 Precision of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1in rat CSF(±s，n=3)

Tab 2 Precision of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1in rat CSF(±s，n=3)

RSD/%Notoginsenoside R1Added/μg·L －1 Intra-day precision Determined/μg·L －1RSD/%Intra-day precision Determined/μg·L－1 25 25.7 ±0.9 3.5 24.0 ±2.0 8.3 100 101.0 ±2.6 2.6 99.1 ±12.1 12.2 400 392.0 ±14.5 3.7 380.0 ±29.6 7.8 Ginsenoside Rg1 50 50.8 ±0.6 1.2 47.8 ±3.8 7.9 200 200.0 ±5.4 2.7 216.0 ±14.9 6.9 800 751.0 ±36.0 4.8 768.0 ±73.0 9.5

Tab 3 Recovery of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1in rat CSF(±s，n=3)

Tab 3 Recovery of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1in rat CSF(±s，n=3)

Added/μg·L －1Recovery/% RSD/%Notoginsenoside R1 Recovery Determined/μg·L －1 25 25.7 ±1.7 102.7 ±6.9 6.7 100 98.2 ±6.5 98.2 ±6.5 6.6 400 391.8 ±31.6 98.0 ±7.9 8.1 Ginsenoside Rg1 50 50.6 ±3.2 101.1 ±6.4 6.3 200 190.7 ±6.5 95.3 ±3.3 3.5 800 751.6 ±39.6 93.9 ±5.0 5.3

3.5 實驗組腦脊液樣品中三七皂苷 R1和人參皂苷Rg1的藥代動力學 大鼠尾靜脈注射三七總皂苷以及解毒通絡方溶液后，三七皂苷 R1和人參皂苷Rg1在腦脊液中的分布濃度數據見Tab 4、5。腦脊液分布濃度－時間曲線見Fig 4、5。藥代動力學參數見 Tab 6、7。

4 討論

本實驗中腦脊液樣本的處理非常簡單，方法回收率較高，而且Q-TRAP 3200型儀器穩定性良好，所以選擇外標法進行定量。

Fig 4 Concentration-time curves of notoginsenoside R1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Fig 5 Concentration-time curves of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 4 Mean concentration of notoginsenoside R1 in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 4 Mean concentration of notoginsenoside R1 in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Time/min PNS/μg·L －1 JDTL/μg·L －1 109.4 ±82.2 97.9 ±86.8 10 188.6 ±166.8 196.0 ±139.4 20 161.2 ±82.0 275.3 ±168.4 40 250.9 ±179.0 319.3 ±216.9 60 195.5 ±160.6 265.2 ±191.8 90 149.7 ±115.5 232.1 ±204.9 120 91.6 ±76.2 133.4 ±89.5 180 67.5 ±48.6 87.8 ±39.6 240 30.2 ±15.8 53.0 ±38.7 5 480 10.2 ±4.0 9.7 ±3.7

Tab 5 Mean concentration of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 5 Mean concentration of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Time/min PNS/μg·L －1 JDTL/μg·L －1 266.3 ±227.4 294.7 ±262.9 10 407.1 ±389.5 526.1 ±418.9 20 367.3 ±212.6 606.3 ±402.1 40 547.0 ±376.7 673.3 ±465.2 60 387.9 ±329.1 553.3 ±434.2 90 286.8 ±231.8 449.0 ±422.0 120 258.3 ±97.2 225.8 ±200.6 180 147.3 ±63.6 107.3 ±80.8 240 88.0 ±47.9 40.8 ±28.0 5 480 15.4 ±7.1 12.6 ±5.1

Tab 6 Pharmacokinetic parameters of notoginsenoside R1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 6 Pharmacokinetic parameters of notoginsenoside R1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Parameters PNS JDTL Tmax/h 0.56 ±0.19 0.83 ±0.60 Cmax/μg·L－1 258.17 ±166.83 344.00 ±195.85 AUC0－t/μg·h·L －1 545.13 ±374.02 774.20 ±301.22 AUC0－∞ /μg·h·L－1 586.21 ±358.57 804.47 ±306.20 T 12/h 2.38 ±1.10 1.64 ±0.11 Ke/h －1 0.33 ±0.12 0.42 ±0.03 CL/L·h－1·kg－14.16 ±3.68 2.03 ±0.79

Tab 7 Pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 7 Pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Parameters PNS JDTL Tmax/h 0.94 ±0.95 0.56 ±0.39 Cmax/μg·L－1 610.67 ±273.96 708.00 ±467.12 AUC0－t/μg·h·L －1 1 244.25 ±443.60 1 325.28 ±918.26 AUC0－∞ /μg·h·L－1 1 400.57 ±423.68 1 355.66 ±917.74 T 12/h 1.49 ±0.07 1.72 ±0.49 Ke/h －1 0.47 ±0.02 0.42 ±0.11 CL/L·h－1·kg－13.19 ±1.02 4.62 ±4.29

目前關于三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的血漿濃度測定已有文獻報道，尚未見文獻報道其在腦脊液中的分析測試方法。本實驗采用HPLC-MS/MS法，建立腦脊液樣品中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的定量分析方法，并研究其在腦脊液中的動態變化過程。實驗結果表明，大鼠尾靜脈注射三七總皂苷以及解毒通絡方5～10 min后，即可在腦脊液中檢測到三七皂苷R1和人參皂苷Rg1，說明兩種成分都可以較快進入大鼠腦脊液中，而且消除速度也較快，8 h后的腦脊液中的濃度已相對較低。

中藥在腦源性疾病治療方面具有較好的療效，這與中藥復方配伍或有效組分配伍應用發揮了多途徑、多靶點的作用有關。中藥配伍應用對損傷的血腦屏障結構有改善和重建作用，還可通過影響轉運體而特異性地影響血腦屏障，從而增加藥物的腦內濃度，這可能就是闡明中藥治療腦源性疾病作用途徑和作用機制的關鍵環節［3］。因此，從腦脊液藥代動力學角度研究中藥有效組分在透過血腦屏障時的協同配伍作用也成為一個新的研究方向，相關研究內容已有文獻報道［4］。從本實驗尾靜脈注射三七總皂苷和解毒通絡方后三七皂苷 R1和人參皂苷Rg1的藥代動力學參數來看，與三七總皂苷相比，解毒通絡方中三七皂苷R1和人參皂苷 Rg1的藥動學參數有一定的波動，但變化不大，說明解毒通絡方復方配伍對于三七皂苷R1和人參皂苷 Rg1在腦脊液中的累積沒有明顯的影響，推測其可能是通過其他途徑發揮配伍作用。

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