扇貝糖胺聚糖對六羥基多巴胺誘導SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用

王大超，侯 琳，鞠傳霞，張金玉，張 崢，鞠晶慧，劉 賽

(青島大學醫學院1.生化教研室、2、藥理學教研室，山東 青島 266021)

研究報道［1－2］多種海洋多糖可通過抗氧化應激發揮神經保護作用，但海洋貝類多糖神經保護活性的研究則鮮有報道。扇貝糖胺聚糖(Chlamys farreri skirts glycosaminoglycan，CFS-GAG)是本組從海洋貝類櫛孔扇貝裙邊中提取的活性成分，已獲專利(專利號:ZL200410035656.3)。已證實 CFSGAG對血管內皮細胞氧化應激損傷有保護作用［3］，本文研究其對六羥基多巴胺(6-OHDA)誘導SH-SY5Y神經元細胞凋亡的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 CFS-GAG(青島大學醫學院藥理室提供);Hoechst 33258、羅丹明123、6-OHDA(Sigma);Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(嘉美生物);反轉錄試劑盒(Promega);一抗和二抗(Amersham pharmacia biotech)。

1.2 細胞培養、分組 SH-SY5Y細胞株購自中國協和醫科大學細胞中心。含10%胎牛血清、1%青、鏈雙抗的DMEM高糖培養基，5%CO2，37℃飽和濕度下培養。分為對照組、模型組(50 μmol·L－16-OHDA 處理24h)、給藥組(6-OHDA 處理前，不同濃度CFS-GAG預處理24 h)。

1.3 Hoechst 33258染色 上述方案處理細胞，4%多聚甲醛4℃，固定 30 min，5 mg·L－1Hoechst 33258 避光染色 10 min，熒光顯微鏡下觀察核形態改變。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染測凋亡率 0.25% 胰酶消化細胞，10 μl Annexin V-FITC 避光孵育 15 min，加入 5 μl PI，孵育5 min，流式細胞儀檢測。

1.5 RT-PCR 測 Bcl-2、Bax mRNA 表達 TRIzol提取RNA，30℃，10 min;42℃，20 min;99℃，5 min;4℃，5 min 反轉錄。PCR 條件:GAPDH:94℃ 3 min，94℃ 90 s，53℃ 1 min，72℃ 90 s，33 個循環;Bcl-2:94℃ 5 min，94℃ 45 s，64℃45 s，72℃ 2 min，33 個循環;Bax:94℃ 7 min，94℃ 1 min，60℃ 45 s，72℃ 45 s，33 個循環。Bcl-2 引物:上游:5'-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3'，下 游:5'-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3'。Bax引物:上游:5'-CTGACATGTTTTCTGACGGC-3'，下 游:5'-TCAGCCCATCTTCTTCCAGA-3'。GAPDH 引 物:上 游:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。2% 瓊脂糖凝膠電泳，光密度掃描分析。

1.6 Western blot測Bcl-2、Bax蛋白表達 細胞裂解液提取總蛋白，蛋白變性，SDS-PAGE電泳，轉膜和封閉。與一抗(兔抗人Bcl-2抗體，1∶300;兔抗人 Bax抗體，1∶300)和過氧化物酶標記二抗(羊抗兔抗體，1∶500)作用。化學發光劑反應，X線片曝光，顯影、定影。圖像分析系統掃描和分析。1.7 流式細胞儀測線粒體膜電位變化 收集細胞，10 mg·L－1羅丹明123，37℃避光孵育15 min，流式細胞儀測熒光強度。

2 結果

2.1 細胞核形態學變化 6-OHDA處理后，觀察到典型凋亡形態學改變:核破碎、染色質聚集，伴DNA碎片，而對照組細胞核呈均勻藍色熒光。400、800 mg·L－1CFS-GAG可抑制凋亡形態學改變。

2.2 CFS-GAG對凋亡率影響 6-OHDA處理后，凋亡率升高，400、800 mg·L－1CFS-GAG 能降低凋亡率(Tab 1)。

Tab 1 Effect of CFS-GAG on apoptotic rate and mitochondrial membrane potential(±s，n=3)

Tab 1 Effect of CFS-GAG on apoptotic rate and mitochondrial membrane potential(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs 6-OHDA;$P＜0.05，$$P＜0.01 vs 200 mg·L －1CFS-GAG;＆＆P ＜0.01 vs 400 mg·L －1CFS-GAG

Group Dose/mg·L －1 Apoptotic rate/% Mitochondrial membrane potential/%of control Control 29.73 ±3.8 100.00 ±2.86 6-OHDA 59.86 ±7.83＊＊ 61.23 ±2.03＊＊CFS-GAG 200 56.09 ±5.1 54.78 ±6.36 400 42.06 ±5.24##$ 70.94 ±2.20##800 29.08 ±3.58##$$＆＆ 69.36 ±2.68##

2.3 CFS-GAG對線粒體膜電位影響 6-OHDA處理后，線粒體膜電位低于對照組，400、800 mg·L－1CFS-GAG能抑制線粒體膜電位的降低(Tab 1)。

2.4 CFS-GAG對Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表達影響 6-OHDA處理后，Bcl-2 mRNA和蛋白表達下降，Bax mRNA和蛋白表達升高，Bcl-2/Bax比值降低。400、800 mg·L－1CFSGAG預處理后，Bcl-2 mRNA和蛋白表達增加，Bcl-2/Bax比值升高(Tab 2)。

3 討論

6-OHDA作用SH-SY5Y細胞后，出現明顯凋亡形態改變，且凋亡率升高，而400、800 mg·L－1CFS-GAG能抑制6-OHDA誘導的凋亡。

Bcl-2抑制細胞凋亡，Bax促進凋亡。Bcl-2/Bax比值降低，可誘導凋亡［4］。Tab 2結果顯示，6-OHDA損傷后，Bcl-2/Bax比值降低，400、800 mg·L－1CFS-GAG 預處理后，Bcl-2/Bax mRNA比值升高。

Bcl-2/Bax比值變化，可引起線粒體膜電位的改變。抑制線粒體膜電位下降，可阻抑細胞凋亡［5］。400、800 mg·L－1CFS-GAG能明顯抑制線粒體膜電位的降低，維持線粒體穩定。

綜上所述，CFS-GAG可能是通過升高Bcl-2/Bax比值，抑制線粒體膜電位下降，抑制6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞凋亡。

Tab 2Effect of CFS-GAG on Bcl-2 and Bax mRNA and protein expression(±s，n=3)

Tab 2Effect of CFS-GAG on Bcl-2 and Bax mRNA and protein expression(±s，n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs 6-OHDA;$$P ＜0.01 vs 200 mg·L－1CFS-GAG;＆P ＜0.05，＆＆P ＜0.01 vs 400 mg·L－1CFSGAG

Group Dose/mg·L－1 mRNA Protein 3 100.00 ±1.73 100.00 ±2.69 100.00 ±1.54 6-OHDA 32.76 ±2.03＊＊ 123.52 ±3.45＊＊ 26.52 ±1.75＊＊ 42.52 ±1.83＊＊ 208.67 ±2.09＊＊ 20.38 ±1.16＊＊CFS-GAG 200 39.11 ±3.30 117.81 ±2.22 33.22 ±3.83 47.38 ±2.91 207.82 ±2.22 22.80 ±1.85 400 72.94 ±2.32##$$ 116.53 ±2.81 62.59 ±1.74##$$ 67.33 ±1.71##$$ 206.53 ±2.81 32.61 ±1.41##$$800 80.42 ±2.98##$$＆ 115.67 ±3.00 69.50 ±1.62##$$＆＆ 76.47 ±2.04##$$＆＆ 205.67 ±3.00 37.20 ±1.66 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax Control 100.00 ±1.34 100.00 ±2.06 100.00 ±1.6 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax##$$＆＆

［1］Cui Y Q，Jia Y J，Zhang T，et al.Fucoidan protects against lipopolysaccharide-induced rat neuronal damage and inhibits the production of proinflammatory mediators in primary microglia［J］.CNS Neurosci Ther，2012，18(10):827 －33.

［2］張 芳，謝俊霞.螺旋藻多糖對MPTP致多巴胺能神經元損傷的保護［J］.中國藥理學通報，2007，23(9):1241－5.

［2］Zhang F，Xie J X.The protective effects of polysaccharide from spirulina platensis on dopaminergic neurons of MPTP-induced Parkinson’s disease model in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(9):1241－5.

［3］張俊玲，劉 賽，王瑞臣，韓紀舉.扇貝糖胺聚糖對OX-LDL致血管內皮細胞損傷的保護作用［J］.中國藥理學通報，2004，20(12):1389－92.

［3］Zhang J L，Liu S，Wang R C，Han J J.The protective effects of scallop skite－glycosaminoglycan on vascular endothelial cell injury induced by OX-LDL［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(12):1389－92.

［4］Vander Heiden M G，Thompson C B.Bcl-2 proteins:regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis［J］.Nat Cell Biol，1999，1(8):E209 －16.

［5］Harada H，Grant S.Apoptosis regulators［J］.Rev Clin Exp Hematol，2003，7(2):117 －38.