經牽涉區皮下局麻藥抑制大鼠子宮炎性痛的實驗研究

張錚錚，陸曉媛，張勵才

(徐州醫學院1.附屬醫院婦產科、2.江蘇省麻醉學重點實驗室，江蘇徐州 221002)

內臟痛是臨床常見的癥狀之一，特別是中、晚期內臟癌癥患者多伴有難以忍受的劇痛，目前仍無確切有效的治療辦法，因此探尋有效治療途徑與方法仍是疼痛研究領域面臨的重要課題。

日常體驗及新近的研究表明，適當的觸摸、按摩、不同頻率的Han’s儀以及經皮電刺激(TENS)等可以減輕疼痛［1－3］，這些治療多以經絡或阿是部位為參考。而解剖學研究表明，許多內臟器官及其牽涉區不在經典的經絡通路上，既然內臟痛可以導致遠離該器官的體表區出現牽涉痛，這說明二者之間必然存在某種內在的形態學聯系。可否利用這種內在聯系經牽涉皮區施加合適的干預因素抑制內臟痛?迄今尚未見有類似的臨床實踐與基礎研究。我們前期的研究表明，預先在牽涉區皮下注射利多卡因，可以明顯減少膀胱傷害性刺激引起的L6～S1脊髓背角Fos陽性細胞的數量［4］，初步提示上述設想可能具有一定的可行性，但不同內臟器官及其牽涉痛是否具有同樣的規律仍需進一步深入研究。

子宮痛(包括子宮癌痛)是婦科常見的臨床疼痛之一，給無數婦女造成嚴重的身心痛苦，目前同樣缺乏有效的治療措施，可否經其牽涉區抑制其疼痛，值得探討。鑒于直接進行人體試驗存在倫理學的限制，而人類與動物的牽涉區也因發育的差異不能完全套用，因此如何重新確認動物子宮痛的“牽涉區”是首先需要解決的關鍵問題。1997年，Wesslmann預先經頸內靜脈向循環系統注入伊文思藍(Evans blue)，然后用芥子油注入大鼠子宮腔制作子宮炎性痛，結果在動物出現子宮炎性痛的同時，其特定體表區(下腹部近恥骨聯合處)恒定出現Evans blue滲漏斑［5］。該實驗幾近模擬了人類牽涉痛現象，客觀地顯示了動物內臟痛與牽涉區的關系，因此較好地解決了動物無法自述其內臟痛牽涉區的難題。

藉此，本實驗擬以Formalin注入子宮制作炎性痛，經其牽涉皮區施加局麻藥，以通用的內臟痛評分法［6］作為整體痛行為定量指標，以公認的與痛程度呈正相關的c-fos原癌基因的表達蛋白Fos在相關脊髓節段的表達量作為分子物質的觀測指標［8］，探討經牽涉皮區抑制子宮痛的可行性，以期為臨床治療內臟痛提供新的途徑與實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 未孕♀ Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質量220～250 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供。動物置于安靜、溫暖、避強光環境內正常喂養72 h以上。隨機分為4組(n=6):A組(單純子宮炎性痛模型組)，乙醚麻醉下，生理鹽水沖洗大鼠陰道，用自制陰道窺器，在目視下將人用硬膜外導管植入子宮腔，深度距陰道外口約4 cm，導入5%Formalin 1.0 ml，留置5 s，不做任何鎮痛處理;B組(非牽涉皮區鎮痛組)，以A組相同方法制作子宮炎性痛模型后，在遠離牽涉區的頸后部皮下注射0.5%的利多卡因0.3 ml作鎮痛處理;C組(牽涉皮區局麻藥鎮痛組)，以B組相同方法制作子宮炎性痛模型后，在牽涉區(恥骨聯合上緣)皮下給予0.5%的利多卡因0.3 ml，實施牽涉區局部鎮痛;D組(正常對照組)，動物常規飼養，不做任何處理。

1.2 行為學評分 各組大鼠在麻醉蘇醒，出現翻正反射1 min后，進行疼痛學評分(S)，評分規則如下:①舔腹部或外陰區為L;②肢體伸展，如伸后肢為B;③軀干扭曲為C;④全身收縮，偶伴痙攣為W，收縮持續時間不足30 s為W1，痙攣在30 s和60 s之間為W2，痙攣多于60 s為W3。計數每15 min內上述4種行為出現的次數，按照公式:S=1L+2B+3C+4W1+5W2+6W3進行疼痛學評分。每15 min為1次，間隔15 min，共3次，持續時間為1.5 h。

1.3 組織制備 各組動物在痛行為學評分觀測完畢后，水合氯醛麻醉，經升主動脈先快速灌注150 ml生理鹽水，再灌注300 ml 4%多聚甲醛溶液(用0.1 mol·L－1PB配制)，先快后慢，約在2 h內完成。灌注后打開椎板暴露脊髓，取出與支配子宮交感神經相關脊髓節段(T10－L1)。在上述相同灌注液中繼續固定(4℃，4～6 h)，5% ～30%的蔗糖磷酸緩沖溶液梯度脫水，直至組織塊下沉。將脊髓組織作連續冰凍切片，片厚20 μm，行Fos免疫組化反應。

1.4 Fos免疫組化反應與計數 切片在溫室下依次入:(1)兔抗血清(1∶2 000，Cambridge Research Biochemical)，孵育過夜;(2)結合生物素的羊抗兔IgG(Vetor，1 ∶200)孵育2 h;(3)ABC 復合物(Vector，1∶200)孵育1 h。其中，一抗和二抗用含0.3%Triton X-100、0.2%馬血清和0.03%NaN3的PBS稀釋。最后切片在含0.05%DAB、0.005%硫酸鎳銨和0.003%H2O2的Tris-HCI緩沖液(pH 7.6)內呈色20～30 min。將切片裱于涂有明膠的載片上，經干燥、脫水、透明后，DPX封片。顯微鏡觀察、攝像Fos免疫反應陽性神經元。選取Fos表達最集中分布區固定序列切片5張，用Image-Pro Plus Version 6.0 圖像分析軟件(Media Cybernetics，Bethesda，USA)，統一在放大100倍條件下，進行Fos陽性神經元數目計數。

2 結果

2.1 各組動物的痛行為評分 動物在麻醉蘇醒出現翻正反射1 min后，根據Miampamba M法分0～15 min，31～45 min，61～75 min 3個時間段，評分并記錄其內臟痛行為表現:子宮炎痛行為主要出現在動物麻醉蘇醒出現翻正反射后的前0～15 min時間段內，其中A(子宮痛模型)組和B(非牽涉區鎮痛組)內臟痛評分明顯增加;C(牽涉區鎮痛)組較A，B內臟痛評分降低，且差異具有統計學意義(P＜0.05)。而在第31～45 min和第61～75 min兩個時間段，A、B、C各組內臟痛評分普遍下降，趨緩。組間差異無統計學意義。D(正常對照)組，偶見舔腹部或外陰區(L)行為，未見 B(伸展)、C(扭曲)、W(痙攣)等行為學表現，各時間段差異亦無統計學意義。如Fig 1所示。

2.2 各組動物脊髓相關節段的Fos表達 不予鎮痛的模型(A)組計數為192.00±7.62;經非牽涉皮區鎮痛(B)組為190.67±7.56;經牽涉皮區鎮痛(C)組為54.83±4.45;正常對照(D)組偶見Fos表達，未作計數。C組與A、B組相比，P＜0.01，差異有統計學意義。A、B兩組相比，差異無統計學意義。各組動物脊髓相關節段的Fos表達的形態學證據見Fig 2。

Fig 1 Score of visceralgia in every group

3 討論

以動物子宮痛條件下Evans blue滲漏斑出現部位作為子宮痛的牽涉區僅見Wesslmann報道，其他內臟器官痛是否具有同樣的現象尚無先例。我們通過復制或模擬Wesslmann的方法，先后觀察了大鼠子宮、膀胱［4］、膽囊［7］、胃［8］等不同內臟器官疼痛的牽涉區，進一步證實以該方法具有普遍的操作性。但應該指出的是，以此法得出的某些內臟器官的牽涉區與既往記載的人類牽涉區部位略有不同，這可能是由于動物與人類胚胎體節生長發育差異所致。

內臟痛的發生機制極其復雜，研究頗多。新近的研究表明，提高雌激素水平可加重內臟痛反應［9］，福爾馬林所致的外周炎性痛可誘導脊髓水平的Fos和前強啡肽蛋白表達增加［11］，加巴噴丁對大鼠直腸乙狀結腸炎性痛具有鎮痛作用［10］。而福爾馬林所致的子宮炎性痛可否誘導相關脊髓水平的Fos表達變化?經牽涉區給予局麻藥物利多卡因抑制子宮炎性痛尚待證實。本研究基于Wesslmann實驗提供的子宮痛牽涉區，觀測了經牽涉區給予局麻藥利多卡因對子宮炎性痛行為及相關脊髓節段Fos蛋白的影響。結果表明Formalin誘導子宮炎痛行為主要在動物麻醉蘇醒出現翻正反射后的前0～15 min時間段內評分明顯升高，提示痛反應劇烈。而在第31～45 min和第61～75 min兩個時間段，內臟痛評分明顯下降，痛反應趨于平緩并減輕。上述結果提示Formalin誘導的子宮(內臟)痛與外周(軀體)痛在行為學反應時相上可能存在異同［12］。即子宮痛的第一時間段(0～15 min)與Formalin誘導的軀體痛的第一時相持續時間與強度近似，而其后的31～75 min時間段的子宮痛程度與Formalin誘導軀體痛的第二時相相比緩解更快，更明顯，確切原因尚待進一步探討。

我們的實驗表明，經牽涉皮區給予局麻藥物可以明顯降低炎性子宮痛的行為學評分，且與之相關脊髓節段的Fos表達量也減少，因此從整體行為與物質分子兩個層面提示經牽涉皮區施加合適的鎮痛措施有可能緩解內臟痛，為臨床內臟痛的治療提供了新的途徑及其實驗依據。

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