豬圓環病毒病原學研究進展

王志軍等

摘 要：豬圓環病毒（porcine circovirus，PCV）有2種不同的血清型，即豬圓環病毒1型（PCV1）和豬圓環病毒2型（PCV2）。目前研究表明PCV1暫無致病性，但PCV2則被認為是引起豬圓環疾病（PCVDs）的主要病原。很多地區養豬業的經濟效益因此而遭受了重大的影響。PCV現已受到全球的關注，引起了許多專家學者的高度重視。本文對PCV的病原學最新研究進展進行了綜述。

關鍵詞：豬圓環病毒；PCV2；病原特性；基因結構

中圖分類號：S852.65+9.2 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.08.017

Abstract： Porcine circovirus virus （PCV） has 2 serotype， named porcine circovirus virus type 1 （PCV1） and porcine circovirus type 2 （PCV2）. PCV1， the first discovered one， has no pathogenity to pigs， while PCV2， the newly defined virus，is recognized as one of the main pathogens for PCVDs. The disease has prevalented in many countries and cause huge economic loss and also pose great challenges to the pig production industry. It is highly valued by scholars in Home and Abroad. This paper reviewed the development of the pathogeny of PCV2.

Key words： porcine circovirus； PCV2； pathogen characteristics； genetic structure

1 發現及分類地位

迄今，人們對豬圓環病毒的起源和進化過程了解得并不多。可追溯的最早的有關于PCV感染豬群的資料是在1962年的德國[1]。Hans Nauwynck 博士通過血清學方法研究證實，豬圓環病毒于20世紀70年代以前就已出現。1974年，Tischer I 等首次報道在PK-15細胞中發現豬圓環病毒（PCV1），由于該病毒不引起細胞發生病變，當時被認為僅僅是一種細胞污染物。通過深入研究，Tischer I 等[2]進一步證實這種細胞污染物實際上是一種單鏈的環狀DNA病毒， 并將其命名為豬圓環病毒。加拿大在1991年報道了一種新豬病——斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（Postweaning pigs multi-systemic wasting syndrome， PMWS）。該國的養豬業由于PMWS在豬群中的廣泛流行而遭受了很大的損失。Harding 和Clark 等從PMWS 的病料中分離鑒定出的病毒與已發現的PCV有70%的同源性，從而認識到該病毒有不同的致病特性，故將無致病性的PCV命名為PCV1，有致病性的命名為PCV2。隨后，PCV2由地方性流行性疾病發展為動物流行性疾病，并在全球的豬群中不斷感染擴散，引發了一系列豬圓環病毒疾病（Porcine circovirus diseases，PCVDs）[3]，該病毒不僅可感染家豬群，也在野豬群中廣泛傳播。雖然很少出現臨床癥狀，但其仍被認為是全球養豬業最重要的病原之一。在PCV2疫苗問世前，亦有諸多專家學者認為與豬圓環相關的疾病（PCV2-systemic disease ，PCV2-SD）的出現和傳播其實與PCV2并無太多關聯，而是與其他某個尚不確定的因素[4] “agent X”[5]有關。然而，也有人認為疾病爆發的主要原因并不是外來的傳染源。隨著PCV2疫苗的問世，PCV2被證明是引發PCV2-SD的主要原因，關于PCV2疾病爆發的“因果論”的爭辯也因此結束，但對于病毒由地方流行性發展為動物流行性的原因還有待進一步的研究。

在第八次國際病毒學會議上，將脊椎動物的圓環病毒分為圓環病毒（Cir-covirus）和環病毒（Gyrovirus）兩個屬。

2 形態結構與理化特性

PCV是已知最小的感染哺乳動物的病毒[6]，其直徑約12～23 nm[7]，呈二十面體對稱，無囊膜，病毒的基因組是一條共價結合的閉環單鏈DNA，衣殼蛋白由單肽鏈組成，分子量為36 kDa。根據其基因序列、致病性和抗原性的差異，將PCV劃分成PCV1和PCV2兩個型。PCV對外界環境的抵抗能力較強，在72 ℃高溫條件下能存活15 min，在酸性環境（如pH3）和氯仿中也能存活很長的時間。該病毒對苯酚、氧化劑、氫氧化鈉和季胺類化合物等比較敏感，以上消毒劑可用于PCV的消毒[8]。PCV沒有血凝活性，不能凝集豬、牛、羊、雞等動物和人的紅細胞[9]。PCV1和PCV2在理化特性方面的差異不是很明顯。

3 組織培養特性

PCV能夠在增殖能力旺盛、正在進行有絲分裂的PK-15細胞上復制，該病毒的復制主要依賴于處于細胞周期S期的細胞蛋白及酶[10]。Tischer等[11]將PCV2接種到沒有污染PCV的PK-15單層細胞上，發現PCV2能夠增殖并形成漿內包涵體或核內包涵體；接種PCV的PK-15細胞用D-氨基葡萄糖處理，對病毒DNA進入細胞核有著促進作用，增加30%的細胞感染量。Stevenson等[12]通過研究發現，適當延長PCV2在PK-15細胞上的培養時間（24 h），也可以獲得良好的病毒增殖效果。除PK-15細胞外，PCV還可以在其他細胞中復制，如牛外周血單核細胞、外周血液細胞、豬骨髓細胞等。但PCV2對RK和Vero細胞的適應性比較差，且在PT、ST、PET等傳代細胞系和BHK-21細胞、恒河猴腎細胞、原代胎豬腎細胞等細胞上不能增殖。Taís F.等[13]發現，如果用收毒技術（Shell vial technique）培養接種于ST細胞的PCV2，可以收到比傳統培養技術更好的效果。

4 基因組特征及分型

PCV的基因組非常小而且核苷酸序列非常保守，PCV1的基因組只含有1 759 nt，PCV2基因組則分為3種：1 766 nt、1 767 nt和1 768 nt。研究表明，PCV1和PCV2可能有相同的進化起源，其中PCV1突變率是每年1.15×10-5個變異位點[14]，PCV2則是每年1.2×10-3個變異位點[15]。不同PCV2毒株之間基因序列的同源性大于96%，而PCV1相對保守，不同毒株之間核苷酸序列的同源性大于99%[16]。PCV1和PCV2核苷酸的相似性是68%，基因序列推導出的aa同源性小于76%。現預測PCV基因組含有11個潛在的開放閱讀框（Open reading frames， ORFs），大部分閱讀框大小相差很大，且存在部分重疊的現象。有一定同源性的開放閱讀框有ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF7和ORF8，其中ORF1、ORF5、ORF7和ORF10的5-3方向均為順時針方向，其余的ORF則為逆時針方向。

迄今，已經報道的PCV2包括4個基因亞型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d。其中PCV2a和PCV2b 是主要的基因型，PCV2c亞型毒株目前只有丹麥分離并報道，而PCV2d不僅發現于中國，可能還出現在歐洲野豬群和南美洲。我國報道的PCV2分離毒株的基因型主要是PCV2a和PCV2b，其中PCV2b已成為近年來國內流行范圍最廣的基因型[17]。雖然PCV2b的流行與各國近年PCVDS的頻繁爆發在時間和空間上可能相符，但PCV2基因型的轉變仍屬于PCVDS進化的未解之謎。

5 復 制

PCV依賴雙鏈DNA （dsDNA）中間體從而完成自身復制，dsDNA 也就是人們說的復制型（Replicative form，RF）。RF是雙義的，其負鏈主要編碼ORF2和ORF3，正鏈主要編碼ORF1。PCV的主要開放閱讀框是ORF1和ORF2，其5'端和3'端分別由基因間區（Intergenic region， IR） Ori和編碼終止處IR隔開。 ORF1非常保守，有研究表明，PCV1和PCV2的rep和Ori可以完全替換；比較而言，ORF2變異程度相對較大[18]。PCV主要在單核巨噬細胞中復制，是能夠在哺乳動物細胞中自主復制的最小病毒，其復制主要是滾環模式。Mankertz等發現，該病毒滾環復制時正鏈合成的起點位于PCV1基因組ORF1與ORF2的中間區域的728～838 nt處，長111 bp。這段片段包括圓環病毒屬特有的莖環結構 TAGTATTACC 或AAGTATTACC （stem-loopstructure），其頂端的保守九核苷酸基序（nonanucleotide motiof）是滾環復制的剪切位點。位于莖環結構下游還有該區域的特異性結構，即4個六聚體重復（5'-CGGCAG-3'） （ H1， H2， H3， H4 ），是病毒復制酶蛋白的結合位點。因為病毒正鏈的起始點和終止點都在這個保守基元中定位，所以病毒復制的關鍵是九核苷酸序列，該保守序列的第7和8個堿基之間被核酸酶切開，進行滾環復制。

6 編碼蛋白

6.1 ORF1編碼的蛋白

ORF1全長945 nt，由312 aa（PCV1）或314 aa（PCV2）組成，分子量大小為35.8 kDa，編碼后可形成分子量約為36 kDa的Rep蛋白，Rep基因轉錄后剪輯的產物為分子量為19.2kDa的Rep'蛋白。Rep必須和Rep'相互作用才可以促進PCV的復制過程，單獨啟動病毒的復制是不可能的。Rep蛋白含有結合dNTPs的P環（P-loop ）結構（序列為G—GKS ）、3個糖基化位點以及與典型滾環復制（RCR）相關的3個保守基序，這些結構對維持Rep蛋白的功能非常重要，發生突變或缺失，均會影響病毒的復制。在PCV2體外感染PK-15細胞的試驗中，該病毒感染后可產生10種RNA[19]，其中5種與Rep蛋白相關，分別為Rep（1 000 nt）， Rep' （750 nt）， Rep3a（280 nt）， Rep3b（280 nt）和Rep3c（470 nt），這些RNA具有相同的5'和3'端核苷酸序列。研究表明，Rep mRNA可能是病毒基因組的初始轉錄物，其余mRNA的功能目前尚不明了。

6.2 ORF2編碼的蛋白

ORF2主要編碼構成病毒衣殼的結構蛋白，即衣殼蛋白（Capsid protein， Cap），該蛋白是由60個Cap亞單位組成的二十面體[20]，包括702個核苷酸，含有233或234個aa，分子量大小約為27.8 kDa。Cap蛋白與病毒和宿主細胞結合有關，且對Rep和Rep'蛋白的復制轉運起一定作用[21]。ORF2基因的啟動子位于Rep基因內部的1 428～1 168 nt處，轉錄起始位點在1 238 nt，轉錄子是一個119 nt的非翻譯引導序列。通過多肽掃描分析，發現PCV2 Cap蛋白上存在一個PCV共同的抗原決定簇及3個特有的抗原位點，即65-87aa， 113-139aa和193-20aa，這一特點為建立區分其它圓環病毒的PCV2的特異性血清學方法奠定了基礎。Fenaux等研究發現，CP110位（P-A）和191位（R-S）氨基酸發生改變可以增強病毒的體外復制，但會減弱病毒在體內的毒力。2003年他們發現用感染性克隆構建的來自PCV1 ORF1及PCV2 ORF2重組病毒在豬體內無致病性。

7 結 語

PCV2所引發的一系列PCVDs給全球養豬業造成了嚴重危害。對于該病及其病原，國內外學者進行了大量的研究，對其相關疫苗的研制也取得了突破性進展[22]，接種疫苗是目前國內外防治該病最有效也是最有收益和回報的方法。但現今仍有許多問題亟待解決：如最近一種發生于接種豬群的新的疾病——急性肺水腫（Acute pulmonary edema ，APE），似乎與PCV2疫苗的接種有關[23]；國外有報道仔豬在接種55 d后分離出了PCV1，且在接種的21 d后出現肺部損傷，似乎證明PCV1也是具有致病性的[24]。因此，我們應該對PCV2的致病機理等問題進行更深入的研究，以期為推進此項研究的發展做出貢獻。

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