胃癌BRCA1基因甲基化與BRCA1 mRNA表達的關系研究

孫欣欣，王紅兵，徐海洋

(1.徐州醫學院研究生學院，江蘇 徐州221002;2.徐州醫學院附屬醫院腫瘤內科，江蘇 徐州221002)

乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)是一個抑癌基因，參與基因的轉錄調節、細胞周期調控、DNA 雙鏈損傷修復、細胞凋亡和泛素化等重要的細胞活動，其中DNA 雙鏈修復途徑主要包括:同源重組修復、非同源末端連接［1-3］。胃癌是常見的惡性腫瘤之一，其發生、發展與癌基因的激活、抑癌基因的失活等因素有關，而基因啟動子CpG 島甲基化是抑癌基因失活的一重要途徑［4］。抑癌基因啟動子CpG 島異常甲基化常常導致其轉錄異常、表達下調甚至缺失，進而導致腫瘤的發生［5］。DNA 甲基化在腫瘤基因表達調控、分化發育、細胞增殖等方面起著重要作用，與腫瘤的發生、發展密切相關，因此成為當前分子學研究熱點之一。目前國內關于BRCA1 基因甲基化與BRCA1 mRNA 表達相關性在腫瘤中研究甚少，而在胃癌組織中尚無文獻報道。本研究采用甲基化特異性PCR 技術檢測37 例胃癌組織和對應癌旁組織及6 例正常胃組織中BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化狀態;采用逆轉錄PCR 技術檢測37 例胃癌組織和對應癌旁組織及6 例正常胃組織中BRCA1 mRNA 表達水平，探討BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化與BRCA1 mRNA 表達的相關性及其意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2013年6月至2013年12月徐州醫學院附屬醫院經病理診斷證實的胃癌組織37 例，同時取其對應癌旁組織，另取6 例胃部良性病變旁正常胃組織作為對照組。所有胃癌患者術前均未接受過放化療，癌旁組織距離癌組織5 cm 以上。37 例患者中，男29 例，女8 例，年齡31 ～80 歲，中位年齡63 歲。所有標本均于術后30 min 內獲得，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑 基因組DNA 提取試劑盒、逆轉錄PCR 相關試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，EZ DNA methylation-Gold、Hot start Taq DNA 聚合酶購自美國Zymo Research 公司，TRIzol 試劑購自美國ABI 公司，引物由上海生工合成。

1.3 方法

1.3.1 組織DNA 提取和甲基化修飾 每個樣本取30 mg 左右組織塊進行勻漿處理，參照組織基因組DNA 提取試劑盒說明書提取基因組DNA，UV3000 紫外分光光度儀測定DNA 濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8 ～2.0 之間的DNA 用于甲基化修飾。各樣本DNA 取1.5 μg，參照EZ DNA 甲基化試劑盒說明書進行甲基化修飾，修飾好的DNA 洗脫后于-20 ℃保存。

1.3.2 甲基化特異性PCR 法 甲基化引物:M，F:5'-TCGTGGTAACGGAAAAGCGC-3'，R:5'- AAATCTCAACGAACTCACGCCG-3'。非甲基化引物:U，F:5'-TTGGTTTTTGTGGTAATGGAAAAGTGT-3'，R:5'-CAAAAAATCTCAACAAACTCACACCA-3'。PCR 反應體系:PCR 混合液(美國Zymo Research 公 司)12.5 μL，上 下 游 引 物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，修飾好的模板2 μL，加無核酶水補足至25 μL。循環條件:95 ℃預變性10 min，然后進行40 個循環擴增:95 ℃變性30 s，甲基化引物及非甲基化引物分別在60 ℃、58 ℃退火55 s，72 ℃延伸30 s，最后于72 ℃延伸7 min。甲基化特異性引物(M)擴增的目的片段為75 bp，非甲基化特異性引物(U)擴增的目的片段為86 bp。取10 μL PCR 產物在3%瓊脂糖凝膠上電泳，以TIANGEN 50 bp DNA Lad-der(MD108-01)為標準DNA Marker 同步電泳，EB 染色后凝膠成像系統觀察結果并記錄。判斷標準［6］:M陽性、U 陰性為完全甲基化;M 陽性、U 陽性為部分甲基化;M 陰性、U 陽性為非甲基化。

1.3.3 RNA 提取及逆轉錄PCR 檢測mRNA 每個樣本取約100 mg 組織，采用Trizol 試劑(按照說明書操作)提取組織總RNA，紫外分光光度計檢測其濃度、純度，取總RNA 1 μg，按照逆轉錄說明書合成cDNA。普通PCR 擴增BRCA1 基因，引物如下:F:5'-TTGCGGGAGGAAAATGGGTAGTTA-3'，R:5'-TGTGCCAAGGGTGAATGATGAAAG-3'，擴增的目的片段為292 bp，內參照選用β-actin，F:5'-AAATCTGGCACCACACCTTC-3'，R:5'-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3'，擴增的目的片段為432 bp。PCR 為25 μL 體系:2 ×Taq PCR Master-Mix(北京天根生化科技有限公司)12.5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，模板cDNA 2 μL，加水至25 μL，95 ℃預變性2 min，然后進行35 個循環擴增:95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，最后于72 ℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果在紫外燈下觀察。根據以下標準判斷結果:432 bp 處出現條帶，同時292 bp 處出現條帶即可判斷該標本BRCA1 mRNA 表達陽性;僅432 bp 處出現條帶則判斷為BRCA1 mRNA 表達陰性。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0 進行數據分析，BRCA1 基因甲基化、BRCA1 mRNA 表達結果比較采用χ2檢驗;BRCA1 基因甲基化與BRCA1 mRNA 表達之間的關系分析采用確切概率法及定性資料相關分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 不同胃組織中BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化狀態 37 例胃癌組織中有18 例甲基化，其中6 例為完全甲基化，12 例為部分甲基化，總甲基化率為48.6%(18/37);對應37 例癌旁組織中2 例部分甲基化，總甲基化率為5.4%(2/37);6 例正常胃組織中均未檢測到BRCA1 基因甲基化，總甲基化率為0. 0%(0/6)。胃癌組織中BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化率顯著高于癌旁組織及正常胃組織，差異有統計學意義(χ2=17.541、5.021，P 均＜0.05)。見圖1。

2.2 不同胃組織中BRCA1 mRNA 表達 37 例胃癌組織中，陽性表達18 例，陽性表達率為48. 6%(18/37);對應37 例癌旁組織中，陽性表達35 例，陽性表達率為94.6%(35/37)，6 例正常胃組織中均陽性表達，陽性表達率100. 0% (6/6)。胃癌組織中BRCA1 mRNA 陽性表達率顯著低于癌旁組織和正常胃組織，差異有統計學意義(χ2=19.215、5.520，P 均＜0.05)。見圖2。

圖1 不同胃組織中BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化檢測結果

圖2 不同胃組織中BRCA1 mRNA 表達情況

2.3 BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化與BRCA1 mRNA 表達的關系 18 例BRCA1 基因啟動子CpG島甲基化的胃癌組織中有4 例BRCA1 mRNA 表達陽性，19 例BRCA1 基因啟動子CpG 島非甲基化的胃癌組織中有14 例BRCA1 mRNA 表達陽性，胃癌組織中發生BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化的BRCA1 mRNA 陽性表達率顯著低于未發生甲基化的胃癌組織(χ2=9. 799，P ＜0. 05)，BRCA1 基因甲基化與BRCA1 mRNA 表達成負相關(r= -0.515，P ＜0.05)。

3 討論

BRCA1 基因是與家族性乳腺癌和卵巢癌相關的基因，定位于人染色體17q21，基因組DNA 長約100 kb，具有24 個外顯子，其中22 個外顯子轉錄7.6 kb mRNA，最終編碼一個由1 863 個氨基酸組成的蛋白質，其相對分子質量為220 000［7］。表觀遺傳學首先提出基因的DNA 序列沒有發生改變，而基因功能發生可遺傳的變異，并最終導致表型的改變，主要包括X 染色體失活、DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA 調控等［8］。DNA 甲基化是表觀遺傳學研究最深入的內容之一［9］，指生物體在DNA 甲基轉移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到特定的堿基上的過程。甲基化主要發生在啟動子CpG 島5'端胞嘧啶堿基，這些位點在正常情況下處于完全非甲基化狀態，CpG 島發生甲基化往往會導致基因的轉錄失活或沉默［10］。近年來研究［11］表明，抑癌基因的啟動子CpG 島異常甲基化導致其功能失活是腫瘤發生的重要機制之一。研究［12］也已證實啟動子CpG 島異常甲基化以及腫瘤相關基因的沉默是胃癌發生的重要機制，p16、APC 等基因甲基化在胃癌中已被研究。

本研究采用甲基化特異性PCR 技術檢測37 例胃癌組織和對應癌旁組織及6 例正常胃組織中BRCA1基因啟動子CpG 島甲基化狀態，結果顯示胃癌組織中總甲基化率為48.65%，顯著高于癌旁組織的5.4%和正常胃組織的0.0%。本研究結果提示胃癌組織中存在高比例的BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化，說明BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化可能參與了胃癌的發生、發展。本研究在2 例癌旁組織中也檢測到BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化，且對應癌組織中均存在該基因完全甲基化，癌旁組織中存在BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化，這一現象可能預示癌旁組織已經處于癌前病變階段。采用逆轉錄PCR 檢測37 例胃癌組織和對應癌旁組織及6 例正常胃組織中BRCA1 mRNA 表達水平，結果顯示，BRCA1 mRNA 的陽性表達率在胃癌組織中為48.6%，明顯低于對應癌旁組織的94. 6% 和正常胃組織的100. 0%。為了證實BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化狀態與BRCA1 mRNA 表達之間的關系，我們對胃癌組織中甲基化組和非甲基化組BRCA1 mRNA 表達的差異進行分析，結果顯示:18 例BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化的胃癌組織中有4 例BRCA1 mRNA 表達陽性，19 例BRCA1基因啟動子CpG 島非甲基化的胃癌組織中有14 例BRCA1 mRNA 表達陽性，而且BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化與BRCA1 mRNA 表達呈顯著負相關(r= -0.515，P ＜0.05)，提示BRCA1 基因啟動子CpG島甲基化是導致BRCA1 基因失表達的原因之一。

綜上所述，我們初步證實了胃癌組織中存在高比例的BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化，BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化可能是導致BRCA1 mRNA 失表達的主要原因之一，BRCA1 基因啟動子CpG 島甲基化與胃癌的發生、發展有一定關系。由于DNA 甲基化是可逆的基因修飾過程，通過逆轉抑癌基因的甲基化狀態，恢復細胞正常生長的調節功能，可能成為胃癌治療的新靶點。

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