超濾分級研究乳清蛋白肽美拉德反應產物的抗氧化活性的影響

孫常雁，李德海，劉騫，孔保華

(1.東北農業大學 a.食品學院，哈爾濱 150030；b.黑龍江省乳品工業技術開發中心，哈爾濱150028；2.東北林業大學 林學院，哈爾濱 150040）

0 引 言

美拉德反應能提高天然蛋白質、肽及氨基酸的乳化性[1]、溶解性[2]、熱穩定性[3]、抗菌性[4]、抗癌性[5]、抗氧化活性[6]和抗過敏性[7]等。但由于MRPs分子組成很復雜，需要分級分離研究，目前多采用膜法進行分離。楊曉泉等[8]利用切向流超濾膜對大豆蛋白肽進行了分級分離并研究其功能性的變化；黃文凱[9]對大豆肽液超濾和納濾脫鹽的分離特性進行了系統的研究；Feng等[10]使用膜將酪蛋白-葡萄糖MRPs分成多個分子量范圍并研究其抗氧活性的差異；徐獻兵等[11]采用超濾膜分離技術研究不同分子量段MRPs的特性。

本研究利用不同分子截留量的超濾膜對WPPMRPs進行了分級分離，目的是分析其抗氧化活性隨分子量分布的變化規律，為WPP-MRPs在功能食品和藥品中的應用提供可行的依據。

1 實 驗

1.1 試驗原料、試劑與儀器

乳清蛋白，ABTS（2,2'-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽），抗壞血酸（Vc）、丁基羥基茴香醚（BHA）、鄰苯二酚紫、硫酸亞鐵、磷酸鹽緩沖液（PBS）、無水乙醇。

紫外可見分光光度計TU－1800，高速萬能粉碎機，R-205B旋轉蒸發儀，超濾膜分離設備，電子天平，恒溫水浴鍋。

1.2 WPP-MRPs的制備

參照本實驗室前期的實驗結果[12]，準確稱取乳清蛋白配成質量分數為5%的乳清蛋白溶液、經95℃預熱5 min，用1 mol/L的NaOH調節溶液pH值到8.5，加入堿性蛋白酶，酶與底物比為2∶100(即每100 g的乳清蛋白底物所需要的堿性蛋白酶的體積為2 mL)，水浴55℃下振蕩水解，反應過程中不斷加入濃度為1 mol/L的NaOH，使pH值保持8.5，水解5 h，之后煮沸5 min滅酶活。

將水解后的乳清蛋白抗氧化肽，加入質量分數為8%的葡萄糖，在一定溫度和磁力攪拌（40 r/min）下加熱，反應一定時間后立即用冰水混合物迅速降溫，終止反應，樣品經1 000 g離心10 min，除去沉淀，上清液凍低溫旋轉蒸發濃縮、冷凍干燥為粉末備用。

1.3 不同分子量分布范圍的WPP-MRPs的分級

利用中空纖維超濾膜將1.2中制備的WPP-MRPs混合物上清液進行超濾分級，使其先后通過截留分子量為5 ku及0.8 ku的的超濾膜進行截流分段，溫度為20℃,壓力為0.1 MPa， 得到I（分子量＜0.8 ku）、II（0.8 ku＜分子量＜5 ku）、III （分子量＞5 ku）3個不同分子量等級WPP-MRPs，然后低溫旋轉蒸發濃縮、冷凍干燥為粉末備用。

1.4 WPP-MRPs抗氧化活性測定

抗氧化能力包括總鐵還原能力、ABTS自由基清除能力、羥基自由基清除、硫代巴比妥酸反應物質（Thiobarbituric acid-reactive substances,TBARS）、 對金屬離子螯合能力。分別測定I、II、III部分WPPMRPs和不分段的WPP-MRPs混合物的抗氧化活性各項指標。

1.4.1 總還原能力測定

參照Kanokwan［13］的方法。分別取樣品溶液0.5 mL(質量濃度為10，20，30，40，50，60，70 g/L)，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(濃度為0.2 mol/L，pH值為6.6)和2.5 mL的質量分數為1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻。再將混合物在50℃下水浴保持20 min后急速冷卻，加入2.5 mL的10%的三氯乙酸溶液，然后將混合物在3 360 g下離心10 min。取2.5 mL上層清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質量分數0.1%的氯化鐵溶液，混合均勻，放置10 min后，在700 nm處測定其吸光值。以Vc為對照，研究WPP-MRPs的還原能力。

1.4.2 ABTS自由基清除的測定

參照Ozgen[14]的方法并略有改動，分別將WPPMRPs配制成質量濃度為10，20，30，40，50，60，70 g/L的樣品溶液。濃度為7.0 mmol/L的ABTS溶液與終濃度為2.45 mmol/L的過硫酸鉀混合，室溫避光放置12～16 h。用pH值為4.5的乙酸鈉溶液（濃度為20 mmol/L）稀釋至波長734 nm處的吸光度為0.7±0.02。取3 mL該溶液與20 μL樣品液混合，放置6 min，于波長734 nm處測定吸光度，以Vc為對照，研究WPP-MRPs的清除ABTS自由基能力。按照下式計算ABTS自由基清除率為

式中：Ac為對照的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.4.3 ·OH自由基清除能力的測定

參照Wang[15]的方法稍作改進，分別將WPP-MRPs配制成質量濃度為10，20，30，40，50，60，70 g/L的樣品溶液。在試管中依次加入濃度為6 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，濃度為6 mmol/L的H2O2溶液1mL和樣品溶液1 mL，搖勻，靜置10 min，再加入濃度為6 mmol/L的水楊酸溶液1 mL，搖勻，靜置30 min后于510 nm波長處測其吸光度。以乙醇溶液代替待測液作空白對照，測定吸光度。以Vc為對照，研究WPP-MRPs的清除羥自由基能力。清除率為

·OH清除率=[1-（A1-A0）/A]×100%，

式中：A為空白對照的吸光度；A0為無水楊酸時加入樣品液的吸光度；A1為加入樣品液的吸光度。

1.4.4 對金屬離子的螯合能力

參照Guo[16]的方法稍作修改進行研究。Cu2+的螯合：用鄰苯二酚紫作為金屬螯合指示劑。向1 mL濃度為2 mmol/L的CuSO4溶液、1mL質量分數為10%的吡啶與20 μL質量分數0.1%的鄰苯二酚紫混合物中添加1 mL的乳清蛋白水解物，鄰苯二酚紫與CuSO4結合形成藍色物質，在有螯合劑存在時鄰苯二酚紫與Cu2+離子分離，溶液藍色消失。鄰苯二酚紫溶液顏色的變化可以在632 nm處測得。

對于Fe2+的螯合：1 mL濃度為20 μmol/L的FeCl2與1 mL濃度為0.5 mmol/L的ferrozine混合后會產生一種物質，在562 nm處有強吸收。向其中添加0.5m L的乳清蛋白水解物，由于Fe2+被螯合，溶液顏色發生變化，在562 nm下讀取吸光值。

螯合作用=[1-(樣品溶液的吸光值/空白溶液的吸光值)]×100。

1.4.5 硫代巴比妥酸反應物質的測定

第一步：脂肪氧化體系(Liposome)的制備

卵磷脂脂質體氧化體系 (soybean phosphatidylcholine liposome)，采用Decker和 Hultin[17]的方法并進行一些改進。將大豆卵磷脂（質量濃度0.2 g/L）溶解在濃度為0.12 mol/L的KCl溶液，濃度為5 mmol/L組氨酸緩沖溶液 (pH值為 6.8)均質后，在4°C進行超聲波降解45 min。為測定樣品的抗氧化活力，準備一系列5 mL脂質體和1 mL各種待測樣品進行試驗。陰性對照用1 mL水代替1 mL樣品溶液與5 mL脂質混合，同時以質量分數為0.02%的BHA作為陽性對照。脂質氧化由鐵的氧化還原反應引發，將0.1 mL濃度為50 mmol/L的FeCl3和0.1 mL濃度為10 mmol/L抗壞血酸鹽加入脂質/蛋白溶液（6 mL）中。樣品在37°C 水浴中保溫1 h，并迅速通過測定硫代巴比妥酸反應物質 （TBARS）研究脂肪氧化情況。

第二步：硫代巴比妥酸反應物質的測定

TBARS的測定，參照Sinnhuber和Yu[18]的方法，并作適當的修改。取1 mL樣品加入3 mL硫代巴比妥酸溶液、17 mL三氯乙酸-鹽酸溶液，混勻后，沸水浴中反應30min，冷卻，取5 mL樣品加入等體積的氯仿，3000 r/min下離心10 min，532 nm下讀取吸光值。TBARS值以每升脂質氧化樣品溶液中丙二醛的毫克數表示。計算為

TBARS(mg/kg)=(A532/Vs)× 9.48，

式中A532為溶液的吸光值；Vs為樣品的體積；9.48為常數。

1.5 統計分析

實驗中測定結果重復測定3次，結果表示為平均數±SD。數據統計分析采用Statistix 8.1(分析軟件,St Paul,MN)軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性(P＜0.05)分析使用Tukey HSD程序，采用sigmaplot9.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 WPP-MRPs總還原能力分析

測定總還原能力實質是基于氧化還原反應的比色法，非酶抗氧化劑可以看作還原劑，把氧化物質還原，從而起到抗氧化劑的作用。本試驗以不同濃度的天然抗氧化劑Vc作為對照，評價WPP-MRPs混合物及不同分子量分布范圍Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的總還原能力。

圖1 WPP-MRPs的還原能力

由圖1可以看出，WPP-MRPs、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Vc均隨著質量濃度的增加，A700值增大，表明還原能力隨之增大，而且還原能力與其濃度成量效關系。其中質量濃度在10～70 g/L之間，Ⅱ的還原能力顯著高于相同質量濃度WPP-MRPs、Ⅰ、Ⅲ及Vc的還原能力（P＜0.05），但是WPP-MRPs混合物的還原能力高于相同濃度Ⅰ、Ⅲ的還原能力，說明具有較好還原力的WPP-MRPs分子量分布在0.8～5 ku之間。當質量濃度為70 g/L時，Ⅱ的A700值為1.551±0.06，WPP-MRPs的A700值為1.26±0.07，分別相當于質量濃度為212.9 mg/L和173.2 mg/L Vc的還原力。結果表明，Ⅱ分子量分布在0.8～5 ku之間的WPP-MRPs具有較強的還原能力。

Ames 等[19]將MRPs分為兩大類：一種是由2～4個含有多個共軛雙鍵的環狀物組成的中低分子量化合物，另一種是量具有發色基團的較高分子的褐色聚合物-類黑精。美拉德反應產物具有一定的還原能力，原因可能為反應過程產生了大量褐色素以及還原酮、吡咯酮、脫氧果糖嗪類等能夠提供氫電子的物質[20]，而氫電子具有還原性，可將Fe3+還原為Fe2+，Fe2+進一步發生Perl’s Prussian反應從而表現出還原能力[21]。Eichner等[22]發現MRPs中等分子量的還原酮類化合物可通過羥基提供電子破壞自由基鏈，表現出較好的還原性。

2.2 WPP-MRPs的ABTS自由基清除能力分析

以不同質量濃度的天然抗氧化劑Vc作為對照，不同分子量的WPP-MRPs的ABTS自由基清除能力。

圖2 WPP-MRPs的ABTS自由基清除能力

由圖2可以看出，對比5種溶液，可以發現乳清蛋白肽美拉德反應物具有較好的清除ABTS自由基能力，可很清楚的看到分段之后，Ⅱ段分子量的美拉德產物清除ABTS自由基的能力略高于Ⅰ段、Ⅲ段和WPP-MRPs的混合物，尤其當Ⅱ段質量濃度為50 g/L時，清除率可達91.49%±3.04%，說明在0.8 ku＜分子量＜5ku的WPP-MRPs具有較強的自由基清除能力。

很多文獻證明了美拉德反應產物具有清除ABTS自由基的能力。Hayase等人[23]研究表明木糖與蛋白的MRPs對ABTS自由基有很好的清除能力；Wagner等人[24]研究了以葡萄糖為模型MRPs也具有較強的ABTS自由基清除能力；另外Nienaber[25]發現抗氧化活性物質主要存在于無色的中低分子量MRPs中，此結論恰好與本試驗結果一致。

2.3 羥基自由基清除能力分析

本研究以不同質量濃度的天然抗氧化劑Vc作為對照，評價不同分子量分布范圍乳清蛋白肽美拉德反應產物羥基自由基清除能力。

圖3 WPP-MRPs的羥基自由基清除能力

由圖3可以看出，當質量濃度在10～40 g/L之間時，WPP-MRPs對羥基自由基清除能力隨著質量濃度的增加而快速增大（P＜0.05），但是質量濃度在50～70 g/L范圍內，WPP-MRPs對羥基自由基清除能力隨著濃度的增幅減小，即增加不顯著（P＞0.05）。而質量濃度在10～70 mg/L范圍內，Vc對羥基自由基清除能力隨著濃度的增加而增大，具有量效關系。當質量濃度為40 g/L時Ⅱ段WPP-MRPs對羥基自由基清除能力99.36%±3.25%，相當于質量濃度為330.2 mg/L的Vc對羥基自由基清除能力。結果表明，WPP-MRPs具有較好的清除羥基自由基能力。

Lusani等[26]研究表明賴氨酸與果糖反應產物具有較強的羥自由基清除能力，羥自由基是活性極強的自由基，幾乎可以與細胞內一切有機物反應，表現在使核酸斷裂、多糖解聚和不飽和脂肪酸過氧化作用，導致遺傳突變、膜損傷、酶失活、線粒體氧化磷酸化作用等一系列變化，進而損傷細胞的機構和功能。

2.4 金屬離子螯合能力分析

許多過渡金屬離子都能促進體內氧化的進行，它們可以催化超氧陰離子產生羥自由基，造成肌體的氧化衰老，而抗氧化劑可以通過螯合金屬離子，間接阻止體內自由基的形成，從而達到抗氧化的目的。本試驗選擇了銅離子和亞鐵離子兩種金屬離子來測定美拉德產物不同組分的抗氧化活性。

圖4 WPP-MRPs亞鐵離子螯合率

各組分亞鐵離子螯合率如圖4。由圖4可以看出，隨著WPP-MRPs質量濃度的增高，螯合亞鐵的能力均略有升高；當質量濃度在10～60 g/L之間時，Ⅲ段的亞鐵離子螯合率明顯高于其他組分；在最大質量濃度70 g/L下，Ⅱ和Ⅲ段的亞鐵離子螯合率達到最高15.65%±1.3%和15.97%±0.7%，二者差異不顯著（P＞0.05），可見大分子的WPP-MRPs對亞鐵離子的螯合能力較強。

圖5 WPP-MRPs銅離子(Cu2+)螯合率

對比圖4和圖5，可以看出WPP-MRPs對銅離子的螯合率明顯高于亞鐵離子，且兩個圖中的WPP-MRPs對金屬螯合能力均明顯高于Vc溶液，該項指標也反映了抗氧化活性的大小，如Jing等[27]提出糖-賴氨酸的MRPs表現抗氧化活性可能通過螯合金屬離子。

螯合金屬能力的差異可能是由于MRPs組分復雜多樣，國內外也有相應的研究，Tan等[28]發現MRPs中具有較強的螯合能力的化合物為還原酮類，Hofmann[29]報道了金屬離子螯合能力主要與MRPs中的大分子物質相關，Eiserich[30]認為雜環化合物也具有很強的螯合鐵離子能力。本研究表明WPP-MRPs中抗氧化性較強的物質是Ⅱ、Ⅲ段即分子量M＞0.8 ku段，原因可能為該分子量中含有較多還原酮結構和雜環化合物；并且分子量M＜0.8 ku的肽段主要成分是小分子量的WPPMRPs及肽、氨基酸和葡萄糖，其螯合金屬能力較差。

2.5 TBARS的分析

食品中的脂類非常容易氧化，發生此變化的原因也很復雜，原因可能是金屬離子產生的促氧化作用，也有可能是某些自由基本身的促氧化作用，因此，WPP-MRPs的抑制脂質氧化可能二者兼而有之。以不同濃度的抗氧化劑BHA作為對照，WPP-MRPs對卵磷脂脂質氧化的抑制作用。

圖6 WPP-MRPs的TBARS的抑制作用

由圖6可以看出，各組分WPP-MRPs均有一定的對脂質抗氧化能力，隨著質量濃度的增大，脂質抗氧化能力不斷增加，但質量濃度超過50 g/L時，抗氧化能力趨于平緩。分子量為0.8 ku＜分子量＜5 ku反應物的抗氧化能略高與其他組分，在質量濃度為50 g/L時，WPP-MRPs、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的TBARS值分別為1.02±0.09，0.83±0.07，0.73 ±0.07和（0.79±0.03）mg/L，差異不顯著（P＞0.05）。 Rao等[31]研究證實了殼聚糖、葡萄糖的美拉德產物具有一定的抑制脂肪氧化作用；目前肽類MRPs對脂質氧化的抑制研究較少，Miranda[32]研究了不同氨基酸美拉德反應產物的脂質抗氧化效果，結果為精氨酸-MRPs＞纈氨酸-MRPs＞組氨酸-MRPs。

本研究可以清晰的看出BHA具有較強的脂質抗氧化能力，其效果明顯高于MRPs，但WPP-MRPs作為普通食品原料，具有一定的脂質抗氧化能力，還將有廣闊的應用空間。

3 結 論

本研究表明經過中空纖維超濾膜分級的WPPMRPs均具有一定抗氧化活性，且隨著質量濃度的增加其抗氧化能力也增強，其中Ⅱ的總還原力、ABTS自由基清除能力和羥基自由基清除能力在同等濃度條件下較Ⅰ和Ⅲ高，而金屬螯合能力主要是分子量較大的Ⅲ表現出較好的螯合率，TBARS值為Ⅱ級具有一定的抑制脂肪氧化能力。本試驗同時與Vc或BHA進行比較，通過增加WPP-MRPs濃度可以達到Vc或BHA的抗氧化效果，說明WPP-MRPs作為食品原料在抗氧化劑領域中應用具有廣闊的開發前景。

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