慢性丙型肝炎患者外周血中CD4+Foxp3+調節性T細胞的變化及其臨床意義

王 萍，胥 冰，張麗君(陜西中醫學院免疫教研室，咸陽 712046;通訊作者，E-mail:smilewangping@163.com)

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染機體后所引起的傳染性疾病，全世界約2億人為HCV感染者，且其中80%感染者為慢性持續感染者，慢性丙型肝炎是引起肝硬化、原發性肝癌重要原因之一。研究證實調節性 T細胞(regulatory T cell，Treg)具有免疫無能和免疫抑制兩大功能，在誘導和維持免疫耐受過程中發揮重要作用［1，2］。國內外研究發現 Treg 細胞在 HBV、HCV、HIV等病毒感染性疾病中發揮一定作用［3］。為進一步研究Treg細胞在慢性丙型肝炎中的作用，本研究擬通過對慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞、核轉錄因子Foxp3及轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的檢測，初步探討Treg細胞在慢性丙型肝炎中的變化及其意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選擇2012-06～2013-03在陜西中醫學院附屬醫院住院和門診治療的慢性丙型肝炎患者60例，其中男性36例，女性24例，年齡20-63歲，平均年齡(37.19±14.07)歲。診斷標準符合2000年中華醫學會傳染病與寄生蟲學分會、肝病學分會聯合修訂的《病毒性肝炎防治方案》［4］，排除標準:排除甲、乙、丁、戊型肝炎及其他病毒性疾病、自身免疫性、惡性腫瘤、藥物及酒精性肝炎及嚴重心腎內分泌疾病等。同期在陜西中醫學院附屬醫院進行體檢的40例健康體檢者作為正常對照組，其中男性22例，女性18 例，年齡18-60 歲，平均年齡(35.67 ±12.39)歲，均排除病毒性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤和藥物及酒精性肝炎。兩組研究對象在性別(χ2=0.246，P=0.619)、年齡(t=0.554，P=0.580)上的差異均無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 CD4+Foxp3+Treg細胞檢測 采用流式細胞術檢測CD4+Foxp3+Treg細胞，利用人淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，并調整細胞濃度為1×106個/ml。500 μl單細胞懸液加入 20 μl FITCCD4抗體，混勻后避光孵育20 min;洗滌離心后分別加入4℃ 1×固定液、37℃ 1×破膜液后洗滌重懸細胞后，加入20 μl PE-Foxp3或同型對照抗體，孵育30 min后洗滌重懸細胞。應用FACS Calibur型流式細胞儀進行檢測，通過Cellquest軟件進行收集分析數據。

1.2.2 Foxp3 mRNA表達水平檢測 采用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應檢測Foxp3 mRNA表達水平，取 500 μl單細胞懸液，加入 1.0 ml TRIzol液提取外周血單個核細胞總RNA，利用cDNA第一鏈合成試劑盒進行第一鏈合成，以上操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。根據文獻合成 Foxp3及內參GAPDH 引物［5］，20 μl PCR 反應體系如下:SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2 × )10 μl、PCR 上下游引物(2 μmol/L)各 2 μl、cDNA 6 μl。擴增條件為:95 ℃ 10 s預變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共45個循環。擴增結束采用2-ΔΔCt分析Foxp3 mRNA基因的相對表達。

1.2.3 血漿中TGF-β1水平檢測 無菌采集靜脈血2.0 ml，1 500 r/min 離心 10 min 分離血漿，采用酶聯免疫試吸附試劑盒檢測血漿中TGF-β1水平，每個樣本設置3個復孔。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞百分率變化

流式細胞分析(以CD4+細胞為門)結果顯示慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞百分率與正常對照組相比明顯升高，差異有統計學意義(P ＜0.05，見圖 1、表1)。

圖1 慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞百分率變化Figure 1 The changes of CD4+Foxp3+Treg cells in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis C by flow cytometry

2.2 慢性丙型肝炎患者外周血Foxp3 mRNA表達水平變化

熒光定量PCR檢測Foxp3 mRNA表達水平結果顯示:與正常對照組相比，慢性丙型肝炎患者外周血Foxp3 mRNA表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P ＜0.05，見表1)。

2.3 慢性丙型肝炎患者血漿中TGF-β1濃度變化

慢性丙型肝炎患者血漿TGF-β1水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義(P＜0.05，見表1)。

表1 兩組研究對象外周血中CD4+Foxp3+Treg細胞、Foxp3 mRNA、TGF-β1水平的比較Table 1 Com parison of the levels of CD4+Foxp3+Treg cells，Foxp3 mRNA and TGF-β1 in the peripheral b lood of patients with chronic hepatitis C between two groups

3 討論

HCV 感染機體后可以誘導機體產生體液免疫和細胞免疫應答，但體液免疫不能有效地清除病毒。隨著對丙型肝炎發病機制研究的不斷深入，目前普遍認為丙型肝炎病毒造成的肝臟損傷及轉歸與機體細胞免疫功能及免疫耐受密切相關。機體免疫功能異常，不能清除HCV，導致病毒長期存在形成慢性感染。研究證實慢性丙型肝炎患者體內HCV特異的CD8+和CD4+T細胞反應活性降低，國內外研究顯示調節性T細胞在慢性丙型肝炎的進展中起到重要的作用［6-10］。

自從1995年日本學者 Sakaguchi等［11］發現調節性T細胞以來，隨著研究深入認為調節性T細胞是一群獨立的細胞，Treg細胞在自身免疫性疾病、腫瘤、移植及感染性疾病中發揮重要作用［1，2］。最近研究證實Treg細胞在HCV感染中也發揮一定作用［6-10］，但研究結果并不完全一致，可能與每個研究的病例選擇、采樣時間、Treg細胞檢測分選手段不同等因素有關。目前普遍認為Foxp3是Treg細胞分化過程中關鍵的轉錄激活因子［12］，因此我們利用CD4+Foxp3+作為檢測Treg細胞的標記。而Treg細胞主要通過分泌 TGF-β1來發揮作用效應［2］，我們同時檢測了HCV患者血漿中TGF-β1的水平。實驗結果顯示慢性丙型肝炎患者CD4+Foxp3+Treg細胞百分率、Foxp3 mRNA及血漿TGF-β1水平與正常對照組相比均明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，這與國內外的研究結果基本一致［5-9］。研究證實Treg細胞具有免疫抑制性和免疫無能性功能，其發揮抑制作用的靶細胞不區分CD4+和CD8+T細胞。在慢性丙型肝炎患者體內CD4+Foxp3+Treg細胞增多，抑制了HCV特異性CD8+T細胞功能，不能完全清除HCV，使病毒長期存在，造成慢性感染。

綜上所述，慢性丙型肝炎患者體內 CD4+Foxp3+Treg細胞及血漿TGF-β1水平增高，發揮了免疫抑制作用，減弱HCV特異性CD8+T淋巴細胞反應，病毒無法清除，造成 HCV慢性感染。但CD4+Foxp3+Treg細胞發揮抑制作用的信號分子及信號傳遞通路尚未完全清楚，深入研究 CD4+Foxp3+Treg細胞與慢性丙型肝炎的關系，可能為闡明丙型肝炎的慢性化機制及指導其治療提供理論及實驗基礎。

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