紫球藻胞外多糖抗氧化和保濕性能的研究

劉紅輝，李敏，汲紅麗，衛東，孫利芹

（煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005）

多糖是一類具有多種生物活性的天然大分子物質，在醫藥、食品、化妝品等多方面具有良好的應用價值。目前對多糖的功能研究主要集中在植物類、真菌和大型海藻、甲殼類等，例如透明質酸、蘆薈凝膠、甲殼素及其衍生物、肝素等已經作為天然活性原料用于化妝品行業[1-4]。隨著海洋微藻生物技術的發展，尤其是考慮到海洋微藻的生長特性，人們將研究的重點轉向海洋微藻多糖的研究。微藻多糖是一種存在于微藻細胞內或胞外的具有抗腫瘤、抗病毒、抗輻射等獨特生物活性的天然大分子物質，目前研究較多的主要有螺旋藻多糖、鹽藻多糖等[5-7]。由于多糖具有良好的成膜性能，可以減少水分蒸發，因此將其作為功能性添加劑在食品、化妝品領域中將有廣泛應用前景。目前，國內外對微藻多糖的吸濕性及保濕性能均鮮有報道，丁紅霞等[6]研究了杜氏鹽藻多糖在皮膚護理中的作用；我們研究了一種金藻多糖的吸濕、保濕功能[8]，都顯示了良好的效果。

紫球藻多糖是由單細胞紅藻紫球藻生長至穩定期后向細胞外分泌的一種水溶性黏多糖，一些學者已經報道了紫球藻多糖的抗病毒、降膽固醇、抗輻射和抗腫瘤作用[9-10]。我們前期已經對紫球藻胞外多糖的理化性質及抗腫瘤、免疫調節及自由基清除能力進行了深入研究[11-12]，但尚未有紫球藻多糖吸濕、保濕性能的研究報道。本研究主要考察紫球藻胞外多糖及其降解產品的總抗氧化能力、吸濕性和保濕活性，以期為海洋微藻多糖作為精細化工原料或功能食品基料應用于化妝品、食品行業提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

紫球藻（Porphyridium cruentum）實驗用藻株由煙臺大學微藻生物技術實驗室純化并保存，紫球藻胞外多糖（EPS0）由煙臺大學微藻生物技術實驗室分離并保存。

1.2 方法

1.2.1 紫球藻胞外多糖的降解與純化

采用超聲輔助H2O2-VC體系誘導產生的自由基降解紫球藻胞外多糖，稱取100 mg多糖，加入各10 mL的抗壞血酸和30%的雙氧水，加蒸餾水使反應體系的終體積為22 mL。抗壞血酸和雙氧水所選用的終濃度如表1所示。

表1 降解因素水平表Table 1 List of degradation factors and levels

1.2.2 紫球藻胞外多糖及降解產品理化性質的測定

分別采用苯酚-硫酸法[13]、咔唑-硫酸法[14]測定各組分多糖樣品的總糖量、硫酸基和糖醛酸含量。

苯酚－硫酸法測定的多糖含量的標準曲線方程為：y=0. 5639x+0. 0338，R2=0. 9931

咔唑-硫酸法測定糖醛酸含量標準曲線方程為：y=0. 4848x+0. 0136，R2=0. 9811

1.2.3 高效液相體積色譜排阻法測定分子量[15]

色譜條件：色譜柱：TSKGel-5000Pw和TSKGel-4000Pw 串聯（10 μm，7.5 mm×300 mm），示差檢測器溫度為35℃，進樣量20 μL；流動相：雙重水，流速為0.8 mL/min，分析時間為30 min。

樣品處理：將被測樣品配成0.2%的溶液，0.22 μm濾膜過濾后，取20 μL濾液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，根據標準曲線計算樣品分子量。

（1）線性關系考察：分別精密吸取木香烴內酯對照品和去氫木香內酯對照品混合溶液2、4、6、8、10、12 μL 進樣，按上述色譜條件測定峰面積，以對照品進樣量為橫坐標（X）、峰面積值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，木香烴內酯回歸方程為Y＝2×106 X－33 173，r＝0.999 5；表明木香烴內酯在0.4～2.4 μg內具有良好的線性關系；去氫木香內酯回歸方程為Y＝1×106 X－56 577，r＝0.999 7；結果表明去氫木香內酯在0.4～2.4 μg內具有良好的線性關系。

1.2.4 多糖樣品的總抗氧化能力測定[16]

取不同濃度梯度的多糖樣品2 mL，加入2.5 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和3 mL濃度為1%鐵氰化鉀溶液充分混合，在30℃水浴中保溫40 min，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，搖勻，4000r/min離心20min，移取3mL上清液于試管中，加3 mL蒸餾水及0.5 mL 0.1%FeCl3，室溫下避光反應40min，在700nm處測定吸光值。以相同的濃度梯度VC作為對照，按照上述方法檢測。

1.2.5 多糖樣品的吸濕活性測定[17]

將待測樣品、對照品及多個稱量瓶置于真空干燥箱內，50℃烘24 h，準確稱取干燥后的EPS0、甘油、透明質酸和殼聚糖各1.00 g于稱量瓶中，在環境溫度為20℃的條件下，將200 mL飽和氯化鈉溶液加入干燥器底部，并保持干燥器內的相對濕度為70%。將稱取的樣品放入濕度及溫度相對恒定的干燥器中并密封。每隔8小時稱重一次，并計算吸濕率。

式中：m0為放置前樣品及稱量瓶總質量，g；mn為放置n小時后樣品及稱量瓶總質量，g；m為所稱量樣品的質量，g。

1.2.6 多糖樣品的保濕活性測定[17]

保持環境溫度為20℃，把250 g變色硅膠置干燥器底部。稱取干燥后的 EPS0、EPS1、EPS2、EPS3、甘油、透明質酸和殼聚糖各1.00 g于稱量瓶，分別向各瓶中加入1.00 mL蒸餾水，充分混勻，置于干燥器。每隔8 h稱重一次，并計算保濕率。

式中：m0為放置前樣品及稱量瓶總質量，g；mn為放置n h后樣品及稱量瓶總質量，g；m為所稱量樣品和1 mL水的總質量，g。

2 結果與分析

2.1 紫球藻多糖降解后經Sepharose-6B柱層析純化

過氧化氫—VC反應體系中產生大量的羥基自由基使糖苷鍵斷裂來降解紫球藻多糖，降解后的糖液經Sepharose-6B瓊脂糖凝膠層析柱純化，所得的洗脫曲線如圖1所示，所獲得的3個組份分別命名為EPS1、EPS2和 EPS3。

2.2 多糖組份純度檢測及分子量測定

各組分紫球藻多糖經高效液相色譜的示差折光檢測法分析后，所得到的結果如圖2至圖5所示。

圖1 降解后的紫球藻多糖Sepharose-6B凝膠柱層析洗脫曲線Fig.1 Gel filtration chromatography of degradation of polysaccharides on Sepharose-6B

除EPS2外，其余幾種組分均為單一對稱峰，表明EPS1、EPS3為均一組分；EPS2出現此種現象的原因可能是由于實驗過程中分段收集時不夠準確，造成成分在一定程度上的混合。通過液相所得的Ve求得Kav值，代入標準曲線方程，計算得出不同組分的多糖的分子量分別為： 3040.88、 1807.59、374.97 和 33.73 ku。

圖2 降解后的紫球藻多糖的高效液相色譜圖Fig.2 High-performance liquid chromatography of degradation of polysaccharides

圖3 EPS1的高效液相色譜圖Fig.3 High-performance liquid chromatography of EPS1

圖4 EPS2的高效液相色譜圖Fig.4 High-performance liquid chromatography of EPS2

圖5 EPS3的高效液相色譜圖Fig.5 High-performance liquid chromatography of EPS3

2.3 紫球藻胞外多糖及降解產品的理化分析

測得的紫球藻多糖及其降解產品的總糖含量和糖醛酸含量的結果見表2。

表2 P.cruentum多糖的理化性質Table 2 Physicochemical property analysis of polysaccharide from Porphyridium cruentum

如表2所示，EPS0及其降解產品的總糖含量皆在68%以上。采用這一反應體系降解得到的多糖，EPS2的糖醛酸含量較低為3.05%，EPS1糖醛酸含量最高，達11.72%，但糖醛酸含量隨著降解程度的增加出現先增加后減少的趨勢，可能的原因是多糖一定程度的降解可以使更多的糖醛酸基團暴露，因此測定的含量增加。但是由于糖醛酸基團容易被氧化，隨著降解程度的增加，過氧化氫濃度也增加，從而使糖醛酸氧化，而表現為測定濃度降低。

2.4 紫球藻多糖樣品的抗氧化能力測定

紫球藻多糖樣品的抗氧化能力測定見圖6。

圖6 紫球藻多糖及其降解產品的抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant activity of polysaccharide and the degraded products

如圖6所示，同一濃度下EPS3與對照組VC的總還原能力接近。不同組分的紫球藻多糖的總還原能力大小為：EPS3＞ EPS2＞EPS1＞ EPS0。紫球藻多糖各組分的總還原能力隨多糖分子量增大而不斷減小。

2.5 紫球藻多糖樣品吸濕活性的測定

本實驗以甘油（Gly）、透明質酸（HA，分子量100ku）和殼聚糖（CTS，分子量50 ku）為對照品。在環境溫度為20℃，相對濕度為70%的恒溫恒濕環境下，考察了紫球藻多糖及對照品的吸濕性能見圖7。

圖7 EPS0、甘油、透明質酸和殼聚糖的吸濕率Fig.7 Absorption rate of ESPS0，glycerin,hyaluronic acid and chitosan

如圖7所示，樣品及對照品的吸濕率大小的順序為：Gly＞ ESPS0＞CTS＞ HA。紫球藻多糖樣品及對照品的吸濕能力在30 h內增長迅速，30 h后除EPS0和Gly的吸濕能力繼續增強外，其余對照樣品的吸濕率基本趨于飽和，且Gly吸濕率的增長幅度大于EPS0。180 h即實驗結束后，EPS0、Gly、CTS和 HA的吸濕率分別為29.00%、52.90%、14.26%和10.46%。實驗結果表明：EPS0、CTS和HA的吸濕率均明顯小于Gly，分別小23.9%、38.64%和42.44%，且EPS0的吸濕率比CTS和HA的大，分別大14.74%和18.54%。因甘油中含3個-OH，親水性極強故其雖為小分子但依然有很大的吸濕率，此外EPS0也表現出了較好的吸濕性能，吸濕率可達29.00%，在樣品和對照品當中僅次于Gly。

2.6 紫球藻多糖樣品保濕活性的測定

紫球藻多糖及其降解產品的保濕效果如圖8所示。

圖8 多糖及其降解產品保濕性能Fig.8 Absorption rate of polysaccharide and the degraded fragments

在環境溫度為20℃的恒溫條件下，利用干燥器法對樣品進行保濕活性的研究，實驗結果表明多糖樣品及對照品的保濕率大小順序為：HA＞CTS＞EPS0＞EPS1＞EPS2＞EPS3＞Gly。各樣品的保濕率隨著時間的減小而減小，其中Gly的保濕性最差，HA的保濕性最強，40 h后保濕率依然高達86.10%，HA的保濕率略高于CTS，ESPS0的保濕效果也比較好，保濕效果略差于CTS，40 h后CTS的保濕率為78.40%，EPS0的保濕率為77.73%。田大聽[18]等對幾種天然多糖的研究結果也證明甘油的保濕性能極差與本實驗結果相似，造成這種結果的原因可能是甘油是小分子，在干燥環境中其小分子結構限制了其與水結合的能力。本研究結果表明，4個不同組分的紫球藻多糖均具有良好的保濕性，三者保濕能力都在40%以上，分別為57.17%、54.85%、45.69%和41.39%。

3 結論

紫球藻多糖的降解產品EPS2的糖醛酸含量較低為3.05%，ESPS1糖醛酸含量最高，達11.72%。而ESPS1的總糖含量最高為71.12%，ESPS2的總糖含量相對較低為68.02%，僅次于ESPS0。總體來說各組分的總糖含量相對較高，均在68%以上。

不同分子量的紫球藻多糖抗氧化能力呈現量效關系，且與其分子量大小呈負相關。同一濃度下，EPS3與對照組VC的抗氧化接近。在吸濕活性測定中，EPS0的吸濕率為29.00%，大于CTS和HA的吸濕率，而小于Gly的吸濕率。紫球藻多糖EPS0及其降解產品ESPS1、ESPS2和 ESPS3保濕率分別為 57.17%、54.85%、45.69%和41.39%，都高于甘油，說明紫球藻多糖及其降解產品均具有良好的吸濕和保濕性能，且與分子量大小成正相關。綜上，紫球藻多糖及其降解產品是一種良好的抗氧化及保濕劑，具有廣泛的的開發與應用前景。

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