不同濃度蟲茶對MC F-7人乳腺癌細胞的體外抗癌效果

張靜，趙欣

（1.重慶市腫瘤醫院婦瘤科，重慶400030；2.重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶400067）

蟲茶是一種主產于我國的不屬于普通茶葉的范疇，但卻以保健茶或藥用茶的形式出現的以昆蟲食葉后排泄的蟲糞粒泡制的奇特茶飲料[1]。生產蟲茶的昆蟲已知有夜蛾科弓須亥夜蛾Hydrillodes morosa Butler.（化香夜蛾、黃紋淡黑夜蛾）與雪疽夜蛾Nodaria niphona Butler.；螟蛾科米縞螟Aglossa dimidiata Haworth.（米黑蟲），黃條谷螟Herculia glaucinalis L.（谷粗喙螟），白條谷螟Fujimacia bicoloralis Leech.，均是以幼蟲取食苦藤茶、苦丁茶、化香樹、大百解、三葉海棠等植物的葉片后，排泄的蟲糞，收集加工即成為蟲茶產品[2]。其中貴州產蟲茶除了遍銷全國還遠銷東南亞，貴州產蟲茶主要是米縞螟弓須亥夜蛾等昆蟲幼蟲啃食樟科潤楠屬的川黔潤楠（Machilus chuanchienensis S.Lee.）腐熟幼嫩葉片后經由昆蟲體內特殊代謝排出糞粒曬干制成[3]。

蟲茶作為傳統飲品和中藥，具有清熱、去暑、解毒、健胃、助消化等功效，對腹瀉、鼻衄、牙齦出血和痔出血均有較好療效，是一種很好的醫藥保健飲料[4]。蟲茶中含有 K、Mg、Ca、Na、Fe、Mn、Zn 等共 17 種礦物質元素，其中約有10種元素為人體必需微量元素，且Fe、Zn、Ca、Mg等元素含量較高，優于一些名優茶[5]。此外，不同蟲茶中還富含有粗蛋白、粗纖維、脂肪、茶多酚、咖啡堿、糖分、維生素和氨基酸[6-7]。近年關于茶葉在抗癌方面的研究已經全免展開，其中類茶類茶飲料的抗癌研究也獲得了初步結果。關于蟲茶的抗癌效果還沒有開展，為了驗證蟲茶的體外抗乳腺癌效果，本研究初步對貴州出產蟲茶進行了MCF-7人乳腺癌細胞體外抗癌功能性的研究。

1 材料與方法

1.1 樣品

蟲茶：市售原產貴州蟲茶，進行冷凍干燥后用沸水3次提取后蒸干后得到水提物，將提取物用二甲基亞砜（DMSO）溶解后待用。

1.2 癌細胞株

MCF-7人乳腺癌細胞（MCF-7 human breast adenocarcinoma cells）購自ATCC（美國典型培養物保藏中心，美國）。

1.3 試劑

DMSO為日本純正化學株式會社產品，D-Biotin、L-histidine·HCI（monohydrate）、D-glucose-6-phosphate（mono sodium salt）、NADP （sodium salt）、Paraformaldehyde、4，6-diamidino-2-phenylindole、ethidium bromide均購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養液、Fetal b ovine serum（FBS）、0.05%trypsin-0.02%EDTA、100unit/mL Penicillin-Streptomycin均購自美國GIBCO公司。Trizol reagent購自美國Invitrogen公司，蛋白檢測試劑盒購自美國Bio-Rad公司，western抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.4 儀器與設備

R-114旋轉蒸發儀：瑞士Buchi公司；VS-15CFN冷凍離心機：韓國Vision科學株式會社；MC096二氧化碳培養箱：日本三洋電機株式會社；HB-402V超凈工作臺、HB-205SW恒溫水浴震蕩器：韓國Hanbeak科學株式會社；PM-1OAK倒置顯微鏡、BXS0熒光顯微鏡：日本奧林巴斯株式會社；Elx800酶標儀：美國Bio Tekinstruments公司。

1.5 方法

1.5.1 MTT法癌細胞體外增殖抑制試驗

將MCF-7人乳腺癌細胞接種于含10%滅活小牛血清的RPMI 1640培養液中，在5%CO2、37℃充分濕化條件下的培養箱中培養，每周更換2～3次培養基，6 d～7 d傳代一次。將培養的癌細胞按1×104個/mL接種于96孔培養板，每孔 180 μL。5%CO2、37℃充分濕化條件下培養24 h。細胞貼壁后按每孔20 μL加入樣品。孔內試驗時，每個樣品設3個劑量組，分別為50、100、200 μg/mL。48 h 培養后，每孔加入 20 μL MTT 試劑（質量濃度為5 mg/mL）繼續培養4 h，結束培養后吸棄孔內上清液后，按每孔150 μL加入DMSO后震蕩30 min，540 nm波長下用酶標儀測定各孔OD值并計算細胞增殖抑制率。抑制率=[（空白孔OD值-樣品孔OD 值）/空白孔 OD 值]×100%[8]。

1.5.2 DAPI熒光染色的癌細胞凋亡觀察

經樣品處理后的癌細胞用PBS洗后用3.7%的多聚甲醛（Paraformaldehyde）常溫下固定細胞10 min，然后用熒光染料 4，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）溶液染色10 min。用PBS溶液漂洗染色后的細胞2次，熒光顯微鏡下進行形態學觀察并拍照[9]。

1.5.3 Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）分析

同等條件下用RNAzol試劑制備MCF-7人乳腺癌細胞總RNA。定量分離到RNA后，以oligo dT為引物，在AMV逆轉錄酶作用下制備ss cDNA，然后以該cDNA為模板，RT-PCR 法擴增 Bax，Bcl-2，caspase-3，9基因（表1）。持家基因glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（GAPDH）作為內參照。實驗結束后，以1%瓊脂電泳（含濃度溴化乙錠）檢查PCR擴增產物[10]。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primers of RT-PCR

1.5.4 Western blot分析

用RIPA細胞裂解液裂解細胞后，分離上清，用蛋白檢測試劑盒測定蛋白質濃度。取30 μg～50 μg蛋白進行SDS-PAGE分離，電印跡至硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜上。將印跡的NC膜依次進行封閉、與第一抗體、第二抗體結合，抗體結合區帶用化學發光法檢測[11]。

2 結果與分析

2.1 蟲茶的體外抗癌作用試驗效果

采用MTT法，檢測蟲茶的體外抗癌效果。結果顯示，蟲茶水提取物對MCF-7人乳腺癌細胞具有一定的抑制作用，且抑制效果隨樣品質量濃度增加而增加。以200 μg/mL濃度處理MCF-7人乳腺癌細胞時，表現出很強的抑制率（78%）。以100、50 μg/mL濃度處理M CF-7人乳腺癌細胞時，癌細胞生長抑制率分別為43%和11%（表2）。由此可見，蟲茶對MCF-7人乳腺癌細胞具有增殖抑制效果，濃度較高時抑制效果更顯著。

表2 MTT法測定蟲茶對MCF-7人乳腺癌細胞的生長抑制效果Table 2 Inhibition of the growth of MCF-7 human breast adenocarcinoma cells by sandy tea as evaluated by MTT assay

2.2 蟲茶誘發癌細胞凋亡的效果

DAPI染色后，凋亡細胞核能發出藍色熒光，通過觀察細胞著色情況我們即可判定細胞是否凋亡。對照組MCF-7人乳腺癌細胞染色后細胞核邊緣清晰，著色均勻。經蟲茶水提取物不同濃度（200、100、50 μg/mL）處理后的MCF-7人乳腺癌細胞均出現了細胞邊緣不規則、細胞核濃染、凋亡小體等典型的細胞凋亡現象，而其中以200 μg/mL濃度作用下表現的更為明顯，見圖1。

圖1 經蟲茶處理后MCF-7人乳腺癌細胞的細胞凋亡情況Fig.1 Appearance of apoptotic body in MCF-7 human breast adenocarcinoma cells treated with sandy tea

可見蟲茶對誘導癌細胞凋亡具有很強的作用，且以200 μg/mL濃度的作用效果明顯。

2.3 蟲茶葉對Bax，Bcl-2和caspases基因的mRNA和蛋白質表達影響

蟲茶水提取物以不同濃度處理MCF-7人乳腺癌細胞，以200 μg/mL濃度處理過的MCF-7人乳腺癌細胞Bax，caspase-3和caspase-9表達最強，以100和50 μg/mL質量濃度處理過的MCF-7人乳腺癌細胞中Bax，caspase-3和caspase-9表達呈現遞減的趨勢；Bal-2的mRNA表達中，經不同質量濃度樣品處理后，隨著濃度的升高表達減弱。由此可以看出，在200μg/mL質量濃度處理下蟲茶對MCF-7人乳腺癌細胞的凋亡作用強于其他濃度（圖2）。

圖2 經蟲茶處理后MCF-7人乳腺癌細胞的Bax，Bcl-2和caspases的mRNA和蛋白質表達Fig.2 Effects of sandy tea on the mRNA and protein expression of Bax，Bcl-2 and caspases in MCF-7 human breast adenocarcinoma cells

3 討論

蟲茶作為一種保健茶葉飲品，其部分功能性已經得到證實。乳腺癌是女性排名第一的常見惡性腫瘤，除了醫學的治療手段外，通過堅持食用保健食品可以預防和幫助治療乳腺癌已經得到證實[12]。對癌細胞增值的體外作用可以從一定程度上證明保健食品的癌預防效果。本文中隨著蟲茶樣品濃度的增加MCF-7人乳腺癌細胞的增值減少，證明蟲茶可以明顯的在體外抑制癌細胞的生長。細胞凋亡是在生理或病理條件下，由基因調控的細胞主動程序化死亡過程。在癌癥發生過程中凋亡相關基因的突變或表達異常可以阻斷癌細胞的凋亡，促使癌癥發生[13]。Bcl-2基因是一種原癌基因，它具有抑制凋亡的作用。Bcl-2可與促凋亡Bax形成二聚體，Bax相對量高于Bcl-2時，Bax同二聚體的數量增多，從而促進細胞死亡[14]。本研究中隨著處理癌細胞的蟲茶濃度的增加，癌細胞的Bax表達加強，Bcl表達減弱，可以認為蟲茶可以促進癌細胞的凋亡，從而起到對乳腺癌的預防作用。Caspase基因選擇性地切割某些蛋白質，從而造成細胞凋亡，caspase-9為凋亡途徑的上游caspase，caspase-3為下游caspase，caspase-9作為啟動性caspase，隨著表達的加強可以加強對下游caspase-3的激活，caspase-3可直接降解胞內的結構蛋白和功能蛋白，引起凋亡[15]。由此可以看出蟲茶對癌細胞的caspase-3和9的作用可促進癌細胞凋亡。本文以貴州蟲茶為基準進行了體外抗癌效能比較實驗，得出蟲茶具有很強的體外抗癌效果的結果。蟲茶對動物的抗癌效果和對人體的臨床作用也有待更深層次的研究。

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