基于正交設計及均勻設計的茯苓多糖提取工藝及多糖特性研究

趙玉英，吳志剛，王二兵

（太原科技大學化學與生物工程學院，山西太原030021）

茯苓（Poria Cocos）是我國的傳統名貴、藥食兩用中藥材。為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，別稱松茯苓、松柏芋、茯菟等，有寧心安神、抑菌殺菌、降血糖、抗病毒、調節免疫力、誘生與促干擾素和白細胞調節素等作用，對人體有較高的保健功能和藥用價值[1-2]。作為茯苓最有效成分之一的茯苓多糖更見長于提高人體免疫機能、防治腫瘤、抗炎等生物學活性。但傳統的茯苓多糖提取方法耗時長，而且提取率較低。目前，超聲技術在植物多糖的提取中已越來越引起人們的重視，超聲提取方法具有高回收率、加熱快速、控溫容易等優點[3]。本實驗分別采用正交設計對茯苓多糖的索氏回流提取和均勻實驗對茯苓多糖的超聲波提取進行提取工藝優化，并對比最佳工藝提取的茯苓多糖的多糖含量、蛋白質及紅外光譜進行比較研究，以期篩選出一種高效、經濟的提取方法，為茯苓的實際生產提供理論參考。

1 儀器與材料

1.1 藥材

茯苓（萬生中藥廠，批號：11120產地：安徽）。

1.2 儀器

SC202型電熱恒溫鼓風干燥箱：浙江嘉興縣新勝電熱儀器制造廠；FW80微型高速萬能試樣粉碎機、HH-2型電熱恒溫水浴鍋、101-1A型電熱鼓風干燥箱、MH-250調溫型電熱套：北京中興偉業儀器有限公司；SHZ-D循環水式真空泵：鞏義市予華儀器公司；RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；HairBCD-215KA DZ型電冰箱：青島海爾股份有限公司；FA1204B型電子天平：上海精密科學儀器有限公司；60目標準篩：浙江上虞金鼎標準篩廠；WKY型微量移液器：上海求精生化試劑儀器有限公司；LD5-10型低速離心機：北京醫用離心機廠；VIS-723G型可見-紫外分光光度計：北京瑞科分析儀器公司；THC-5B超聲波提取機：濟寧天華超聲電子儀器有限公司；紅外光譜儀：北京東訊天地醫療儀器有限公司。

1.3 試劑

95%乙醇、葡萄糖、三氯甲烷、苯酚、丙酮、正丁醇、濃硫酸、無水乙醇，以上試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 茯苓多糖的提取

原料→烘干（48±2℃下恒溫干燥48 h）→粉碎（過60目篩）→稱樣→配比→回流﹙脫單糖﹚→索氏提取﹙脫脂﹚→提取多糖→Sevag除蛋白→水層離心→取上清液→濃縮→放置冰箱→棄上清液→揮干→殘渣恒溫干燥→得茯苓水溶性多糖樣品→測吸光度→記錄數據→計算多糖含量

2.2 茯苓的預處理

將茯苓藥材在（48±2）℃下恒溫干燥48 h，趁熱粉碎過60目篩。取上述粉末20 g，分別加入80%乙醇90 mL回流提取1 h，棄去上清液，殘渣中加入80%乙醇90 mL，回流提取1 h，揮干，在殘渣中加入80%乙醇90 mL，靜置12 h，棄去上清液，在殘渣中再加入80%乙醇90 mL，索氏提取2 h，將殘渣干燥，得茯苓樣品粉末，稱重。

2.3 茯苓多糖的純化

在提取的茯苓多糖液體中加入三氯甲烷：正丁醇（5 ∶1）60 mL，振搖 30 min，靜置過夜，棄去有機層，水層以 3000 r/min離心10 min；取上清液濃縮至約15 mL左右，加入95%乙醇使溶液含醇量達85%，放置冰箱過夜，棄去上清液，揮去乙醇，殘渣在60℃下恒溫干燥，即得茯苓水溶性多糖樣品。

2.4 多糖含量的測定

本實驗采用苯酚-硫酸法進行多糖含量的計算。

2.4.1 對照品溶液的制備

精密稱取經105℃干燥至恒重的無水葡萄糖15.3 mg，加適量水溶解，定量轉移至25 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用。

2.4.2 供試品溶液的制備

精密稱取各樣品粉末約0. 0125 g，取適量水溶解，定量轉移至25 mL容量瓶中，搖勻備用。

2.4.3 標準曲線的制備

精密量取葡萄糖標準溶液 0、100、120、140、160、180 μL置于具塞試管中，依次加入蒸餾水2.00、1.90、1.88、1.86、1.84、1.82 mL，5%苯酚溶液 1.0 mL，濃硫酸7.0 mL，搖勻備用。將上述具塞試管于沸水浴中加熱15 min，取出冷卻5 min，再放入冷水浴中15 min，取出，于486 nm，在此波長下測定各標準溶液的吸光度（A）。以吸光度A為縱坐標，標準液濃度C（μg/mL）為橫坐標，得到葡萄糖溶液的標準線方程：A=0.040C-0.034（r=0.999），結果表明葡萄糖在 6.0 μg/mL～10.8 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.4.4 樣品中多糖的測定。

取各樣品溶液100 μL于具塞試管中，依次加入1.9 mL蒸餾水，1.0 mL苯酚，7.0 mL濃硫酸，搖勻。將上述具塞試管于沸水浴中加熱15 min，取出冷卻5 min，再放入冷水浴中15 min，取出，在486 nm處測定各樣品溶液的吸光度值，計算多糖含量。

2.5 茯苓多糖的索氏回流提取法

選擇固液比、提取時間和提取次數3個因素[4]，以多糖含量為考察指標，選擇L9（34）正交表進行實驗，因素水平安排見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Orthogonal test table

2.6 茯苓多糖的超聲波提取法

選擇提取溫度、提取時間、超聲功率和固液比四個因素[5]，以多糖含量為考察指標，選擇均勻設計表中的U64進行實驗，因素水平安排見表2。

表2 均勻實驗因素水平表Table 2 Uniform experiment test table

2.7 茯苓多糖的紅外分析方法

精密稱取樣品1 mg，光譜純、干燥的KBr粉末200 mg，在瑪瑙乳缽中研細、混勻，壓片制樣品。測定條件為：光譜范圍為 4000cm-1～400cm-1，分辨率為 4cm-1，掃描次數為16次。結果采用GRAMS/32AI軟件進行分析。

2.8 茯苓多糖的紫外分析方法

取茯苓多糖加水溶解，配制成濃度為0.08 g/L的多糖水溶液，在200 nm～400 nm波長范圍內，使用紫外分光光度計對多糖溶液進行紫外掃描，分析多糖溶液的吸收情況，以判斷有無核酸和蛋白質的吸收峰。

3 結果

3.1 茯苓多糖含量的測定的方法學考察

3.1.1 精密度試驗

精密量取對照品溶液0.8 mL于具塞試管中，測定A值，重復測定6次，結果A值的RSD為0.091%。

3.1.2 穩定性試驗

精密量取供試品溶液100 μL于具塞試管中，測定A值，每隔30 min測定1次，結果A值的RSD為0.907%，表明供試品溶液在3 h內穩定。

3.1.3 重現性試驗

制備供試品溶液，平行6份，各精密量取100 μL于具塞試管中，測定A值，計算其質量分數的RSD為1.636%。

3.1.4 加樣回收率試驗

精密量取樣品溶液50μL，平行6份，均加入50μL的對照品溶液，測定A值，計算回收率，結果平均回收率為99.68%，RSD為1.893%。

3.2 茯苓多糖的索氏回流提取法實驗結果

表3正交實驗結果表明，固液比和提取次數對提取收率的影響顯著，而提取時間影響較小。比較R值的大小可以看出，各因素的影響順序為：固液比＞提取次數＞提取時間；比較K值可以看出，傳統法對茯苓多糖的提取最佳條件為：固液比1∶60，提取次數4，提取時間5h，多糖提取率為1.247%。從表4得知A因素固液比在α=0.10水平具有顯著性，其他因素無顯著性。

表3 正交實驗直觀分析表Table 3 Orthogonal test results and variance analysis

表4 方差分析表Table 4 The Variance analysis

3.3 茯苓多糖的超聲波提取法實驗結果

采用均勻設計所得超聲波法提取茯苓多糖的實驗結果如表5所示。直觀分析表明3號多糖含量最高，故選取3號為多糖較適宜的提取條件，即超聲波功率400W，提取時間60 min，固液比1∶40，提取溫度為45℃。

3.4 兩種提取法提取的茯苓多糖比較研究

1）兩種提取法提取的茯苓多糖含量的比較。對兩種提取方法的最佳提取工藝所得茯苓多糖含量進行對比，如圖1-A，可知，無論是超聲波提取，還是傳統提取，多糖含量無顯著性差異，這說明兩種方法在提取多糖上差不多。但相比而言超聲波提取迅速、方法簡便。

表5 超聲波提取茯苓多糖含量Table 5 Content of poria cocos polysaccharide by ultrasonic extraction

2）兩種提取法提取的茯苓多糖中蛋白質分析。如圖1-B，在200 nm～400 nm的波長范圍內對茯苓多糖進行紫外掃描，光譜顯示茯苓多糖具有多糖特征性的紫外吸收圖譜。多糖在200 nm處均有強多糖吸收峰，大于250 nm無明顯的紫外吸收。蛋白質特征吸收峰在280 nm，核酸在260 nm附近，多糖在260 nm及280 nm處無明顯的特征吸收峰。結果表明，茯苓多糖中不含核酸、蛋白質。

圖1 兩種提取法所得茯苓多糖比較Fig.1 Comparation of poria cocos polysaccharide by two extraction method

3）兩種提取法提取的茯苓多糖的FTIR分析。

圖2 兩種提取法所得茯苓多糖的紅外圖譜Fig.2 The FTIR spectrums of poria cocos polysaccharide by two extraction method

從圖2中可以看出，兩種提取方法所得水溶性茯苓多糖的紅外吸收譜型基本相同，在 3383.9 cm-1處出現了一個寬峰，是O-H的伸縮振動，是表示在多糖間存在分子內和分子間氫鍵；在 2800 cm-1～3000 cm-1范圍的吸收峰是糖類的特征峰，茯苓多糖有在2934.2cm-1處的吸收峰，是由多糖分子的C-H伸縮振動引起的。 1429.1 cm-1是羧基的C-O伸縮振動引起的吸收峰，1368.3 cm-1處弱的吸收峰為C-H的變角運動引起的，762.74 cm-1處是D-葡萄吡喃糖環C-O-C的振動吸收峰，1044 cm-1～1079 cm-1附近出現的吸收峰是常見的吡喃糖環內酯和羥基的共振吸收峰，是由C-O-C醚鍵的不對稱伸縮振動引起的，是糖類的特征吸收峰，也是葡萄糖的紅外光譜信號。不同的是，二者確定吸收峰處的峰形（高度和寬度）略有差異，這可能是由于水溶性茯苓多糖超分子結構體系中的分子內和分子間氫鍵發生變化所導致。

4 結論

超聲波提取法與索氏回流提取法所提取的茯苓多糖量相差無幾，相比而言超聲波處理能夠破壞茯苓細胞結構，促使多糖更多更快地轉移至提取溶劑中，從而提高提取效率，故超聲波提取迅速、方法簡便易行。

[1] 陳春霞.茯苓多糖體的藥理藥化研究及其臨床應用的初探[J].中草藥,1985,16(4)：40-44

[2] 孫元琳,楊萍芳,吳海霞,等.水法提取當歸多糖工藝條件優化[J].中國食品學報,2009,9(5)：130-134

[3] 張穎.對茯苓多糖提取方法的比較研究[J].中國實用醫藥,2012,2(4)：249-250

[4] 霍文,孫廣利,劉鵬.正交試驗法優選茯苓多糖提取工藝[J].西北藥學雜志,2006,2(1)：18-19

[5] 趙子劍,陳迪釗,連琰,等.均勻設計法優化超聲波提取茯苓多糖工藝條件的研究[J].時珍國醫國藥,2009,20(2)：325-326