培養(yǎng)基組成對(duì)布拉氏酵母生長(zhǎng)的影響及其優(yōu)化

杜曉蒙，陶如玉，圣志存，賈士儒

（教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)，天津300457）

布拉氏酵母是法國科學(xué)家HenriBoulard于1923年從印尼水果荔枝中分離得到的一株適溫、非毒性酵母菌株，一般認(rèn)為是釀酒酵母的亞種[1]。目前布拉氏酵母廣泛用于預(yù)防和治療各種腹瀉、腸道炎癥[1-2]。藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示，連續(xù)口服之后，布拉氏酵母能夠在結(jié)腸內(nèi)穩(wěn)定存在3天左右，停藥之后則會(huì)隨糞便排出，不會(huì)在腸道內(nèi)定植[3-4]。另外，使用細(xì)菌作為益生菌的最大危險(xiǎn)是其可能會(huì)將耐藥基因傳給致病菌，而酵母不存在此類問題，是安全的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑[5]。在許多國家，布拉氏酵母作為凍干產(chǎn)品用于預(yù)防兒童和成人的腹瀉[2，6]。此外，布拉氏酵母制劑還能夠增強(qiáng)微生態(tài)平衡，刺激免疫系統(tǒng)，作為飼料添加劑的應(yīng)用已得到包括中國在內(nèi)的許多國家的認(rèn)可，因此在畜牧業(yè)中必將有廣闊的應(yīng)用前景[7-10]。

作為微生態(tài)制劑，要保證其生物療效，腸道內(nèi)必須達(dá)到足夠數(shù)量的活菌數(shù)，因此本文以布拉氏酵母菌為菌株，研究了不同培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件對(duì)其生物量積累的影響，初步確定最有利于菌體生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件，之后利用正交試驗(yàn)確定益生菌布拉氏酵母的最適搖瓶培養(yǎng)條件[11]，為其活菌制劑的生產(chǎn)制備提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

布拉氏酵母菌由天津科技大學(xué)生化工程研究室分離篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖4%，蛋白胨1%，pH5.0；初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH5.0。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)過程及生物量測(cè)定

挑取布拉氏酵母接種至種子培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，以7%接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)其生物量及殘?zhí)呛縖12]。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

分別以碳源種類、氮源種類、磷酸二氫鉀濃度、硫酸鎂濃度為影響因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以菌體量、光密度為指標(biāo)研究各因素對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響及其最適水平。

1.2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以葡萄糖、酵母膏、磷酸二氫鉀及硫酸鎂濃度為考察因素，以布拉氏酵母菌體干重（DCW）為考察指標(biāo)，進(jìn)行L16（44）正交試驗(yàn)，研究各因素對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響[13]，因素水平表如表1所示，共16個(gè)實(shí)驗(yàn)組。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 培養(yǎng)條件對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

在正交試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，研究接種量和培養(yǎng)基初始pH對(duì)酵母生物量的影響，實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.1。

2 結(jié)果與討論

2.1 布拉氏酵母生長(zhǎng)曲線

利用Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀繪制布拉氏酵母生長(zhǎng)曲線[14]，結(jié)果如圖1所示，接種后0～4 h處于延滯期，4 h～24 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24 h之后進(jìn)入穩(wěn)定期。因此試驗(yàn)過程中種子液的培養(yǎng)時(shí)間選擇對(duì)數(shù)期12 h，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間 24 h[15]。

2.2 培養(yǎng)基組成對(duì)布拉氏酵母生長(zhǎng)的影響

2.2.1 碳源種類對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，以麥芽糖為碳源時(shí)酵母生物量最高，比葡萄糖組高9.4%；乳糖組生物量最低，其原因可能在于布拉氏酵母菌降解或發(fā)酵乳糖的能力較差[14]。鑒于蔗糖成本高于葡萄糖，而且葡萄糖是最容易利用的碳源之一[15]，因此綜合考慮，選擇葡萄糖為碳源較為適宜。

圖1 布拉氏酵母生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Saccharomyces boulardii

圖2 碳源種類對(duì)布拉氏酵母生物量的影響Fig.2 Effect of carbon sources on the biomass

2.2.2 氮源種類對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

氮源種類對(duì)布拉氏酵母生長(zhǎng)的影響見圖3。

圖3 氮源種類對(duì)布拉氏酵母生物量的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on biomass

無機(jī)氮源對(duì)布拉氏酵母生物量的影響相差不大，菌體量都很低，耗糖很少；而有機(jī)氮源組的生物量比無機(jī)氮源組高出三倍以上，葡萄糖幾乎全部耗完，其中以酵母膏的效果最好，其原因在于酵母膏含豐富的蛋白質(zhì)、多肽和游離氨基酸以及維生素、生長(zhǎng)因子等[15]，因此它能夠使布拉氏酵母迅速繁殖，后續(xù)試驗(yàn)選擇酵母膏為培養(yǎng)基氮源。

2.2.3 磷酸二氫鉀濃度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

磷是蛋白質(zhì)和核酸的必要成分，也是三磷酸腺苷ATP的組成成分，因此磷元素的含量對(duì)微生物的生長(zhǎng)也有一定影響[15]。試驗(yàn)結(jié)果如圖4，磷酸二氫鉀濃度為0.8 g/L時(shí)，酵母生物量最大，之后隨濃度上升生物量開始降低。

圖4 磷酸二氫鉀濃度對(duì)布拉氏酵母生物量的影響Fig.4 Effect of Potassium Phosphate Monobasic concentration on the biomass

2.2.4 硫酸鎂濃度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

鎂處于離子狀態(tài)時(shí)，是許多重要酶的激活劑，也是發(fā)酵過程中不可缺少的成分[15]。硫酸鎂濃度對(duì)布拉氏酵母生物量的影響如圖5。

圖5 硫酸鎂濃度對(duì)布拉氏酵母生物量的影響Fig.5 The effect of magnesium sulfate heptahydrate concentration on the biomass

由圖5所示，添加鎂離子對(duì)布拉氏酵母的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)其濃度為0.05%時(shí)，菌體生物量最大，因此初步確定培養(yǎng)基中硫酸鎂濃度為0.5 g/L。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果如表2。四個(gè)影響因素對(duì)布拉氏酵母生物量的影響大小順序?yàn)锳＞B＞D＞C，即葡萄糖濃度的高低是布拉氏酵母生長(zhǎng)最重要的調(diào)控因子[17]，硫酸鎂濃度影響最小。

發(fā)酵培養(yǎng)基的方差分析見表3，結(jié)果表明，四個(gè)影響因素中，葡萄糖和酵母膏濃度對(duì)布拉氏酵母生物量均有顯著性影響。綜合表2和表3確定培養(yǎng)基的優(yōu)方案為A4B3C2D2，即布拉氏酵母培養(yǎng)基組成為葡萄糖45g/L，酵母膏12 g/L，磷酸二氫鉀0.8 g/L和硫酸鎂0.5 g/L，此時(shí)布拉氏酵母菌體干重為6.3 g/L。

表2 L16（44）正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2The results and analysis of the L16（44）orthogonal test

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基的方差分析表Table 3 Variance analysis of fermentation media

2.4 培養(yǎng)條件對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

2.4.1 pH對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)基的pH會(huì)影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌，還會(huì)影響培養(yǎng)基中某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解[15]，因此pH是影響微生物生長(zhǎng)極為重要的環(huán)境因子。圖6顯示，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH5.5時(shí)酵母生物量最大，pH偏高或偏低均不利于布拉氏酵母的生長(zhǎng)。

2.4.2 接種量對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

圖6 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.6 The effect of initial pH on the biomass of S.boulardii

圖7 接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.7 The effect of incubation size on the biomass of S.boulardii

接種量對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響由圖7所示，種子液接種量為9%時(shí)生物量達(dá)到最大值，增大或減小接種量其生物量均有所降低。研究表明，接種量過多，培養(yǎng)液黏度增加，造成溶氧不足，反而會(huì)影響菌體生長(zhǎng)；接種量過小則會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期，并且容易染菌[15]。因此培養(yǎng)過程取接種量為9%，在此條件下培養(yǎng)布拉氏酵母24 h后其細(xì)胞干重為6.5 g/L。

3 結(jié)論

本研究確定了搖瓶培養(yǎng)布拉氏酵母的培養(yǎng)條件為葡萄糖45 g/L，酵母膏12 g/L，磷酸二氫鉀0.8 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，初始pH5.5，接種量9%。在此條件下，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后細(xì)胞干重達(dá)到6.5 g/L，對(duì)于益生菌布拉氏酵母在畜牧業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用具有實(shí)際意義。

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