穩定同位素碳、氮在冬蟲夏草原產地鑒別中的應用*

李輝，姚粟，劉洋，白飛榮，扎西·才吉，程池

1(中國食品發酵工業研究院中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

2(玉樹藏族自治州三江源藥業有限公司，青海玉樹，810003)

冬蟲夏草(Ophicordyceps sinensis)是我國青藏高原地區的珍稀物種資源，富含蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖、麥角甾醇等多種生物活性物質，具有獨特的保健功能和特殊藥效［1］。不同來源的冬蟲夏草由于受到當地土壤、氣候以及其他生長環境因素的影響，在蟲體的大小，飽滿度以及有效成分的含量上存在較大差異，因而經濟價值也不同。目前，市場上產于青海玉樹、果洛，西藏那曲等地區的冬蟲夏草由于蟲體大而飽滿，價格要高于其他產地的蟲草，一些不法商家為謀取高額利潤，常常以其他產地蟲草冒充玉樹、果洛或那曲蟲草銷售，嚴重損害了消費者利益，不利于冬蟲夏草產業的健康有序發展。

目前，我國尚未建立穩定有效的冬蟲夏草的原產地鑒別技術方法。長期以來，我國對冬蟲夏草產地鑒別技術主要集中于冬蟲夏草的形態學、理化指標的分析和檢測方法等方面［2］，這類常規方法操作復雜，且檢測指標尚不完善，在準確性和高效性方面存在一定的局限性。近年來，一些研究者陸續將隨機擴增多態性DNA(RAPD)［3］、簡單序列重復區間擴增多態性(ISSR)［4］等分子生物學技術應用于冬蟲夏草產地鑒別，但是同一個產地冬蟲夏草樣品之間本身就存在著較大的遺傳差異(主要在于冬蟲夏草寄生的蝙蝠蛾幼蟲種類不同)，這類通過分子遺傳差異來鑒別冬蟲夏草的技術很難產生重復性好，穩定性高的結果。因此，建立一套快速、準確的冬蟲夏草原草原產地鑒別方法成為亟需解決的問題。

穩定同位素分析技術在過去30多年間，已在食品生產的某些領域，如葡萄酒、飲料、蜂蜜等［5-7］的產地鑒別中成功應用，有些同位素方法已得到官方分析化學家協會(AOAC)及歐洲標準化委員會(CEN)的認可［8］。近年來，其在中藥材的地理來源溯源分析中也開始有應用的報道，如Micha Horacek等［9］利用C、N、H等穩定同位素對來源于中國和韓國的人參展開產地鑒別研究，對29種樣品進行了準確的產地鑒別，并認為該技術是一種穩定有效的產地鑒別技術。

本課題組在前人研究的基礎上，利用同位素比值質譜儀對不同產區冬蟲夏草樣品的N、C穩定同位素進行測定分析和比對研究，試圖建立一種快速有效的冬蟲夏草穩定同位素溯源技術方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 冬蟲夏草樣品

本研究收集了來自我國青海省、四川省、云南省以及尼泊爾的12個不同產區冬蟲夏草樣品，以及來自貴州省、江西省和湖南省的3種亞香棒蟲草樣品。

1.1.2 主要儀器

Delta v Advantage穩定同位素比值質譜儀、Flash EA1112元素分析儀、ConfloⅢ稀釋儀，美國 Thermo Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 冬蟲夏草樣品的前處理

取冬蟲夏草樣品一支，用去離子水浸泡清洗，在60℃恒溫干燥12 h，用V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=2∶1混合液浸泡2 h進行脫脂，用去離子水清洗、浸泡30 min，再用 V(三氯甲烷)∶V(甲醇)2∶1混合液浸泡。最后用去離子水清洗，60℃干燥后采用組織研磨儀研磨至粉末狀，轉移至1.5 mL離心管中保存。

1.2.2 穩定同位素的測定

分別取1.0 mg和0.5 mg前處理后的樣品，用錫箔杯包好后通過自動采樣器送到元素分析儀中，將樣品中的氮元素轉化成為N2和CO2氣體，再經過稀釋儀，最后進入質譜儀進行檢測。具體參數如下:

元素分析儀:進樣器氦氣吹掃流量為200 mL/min，氧化爐溫度為980℃，還原爐溫度為650℃，載氣氦氣流量為90 mL/min。稀釋儀:氦氣稀釋壓力為60 kPa，N2和CO2參考氣壓力均為60 kPa。

1.2.3 數據處理和統計分析

同位素測定結果以 δ‰表示:δ‰ =(R樣品/R標準-1)×1 000，R代表樣品和標準物質中重同位素與輕同位素的豐度比，δ13C的標準物質為V-PDB，δ15N的相對標準物質為空氣。

采用Origin8.0軟件對樣品的δ15N和δ13C數據進行分析，獲得不同來源冬蟲夏草和亞香棒蟲草樣品的箱線圖，并采用雙樣品t檢驗法，檢驗來源于青海玉樹、果洛冬蟲夏草樣品和其他地區冬蟲夏草樣品的顯著性差異，以及冬蟲夏草樣品和亞香棒蟲草樣品的顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 冬蟲夏草N穩定同位素比值分析

12種不同來源冬蟲夏草樣品和3種亞香棒蟲草樣品的δ15N值測定結果見表1。其中來源于青海樣品的δ15N值范圍為-0.220‰～2.195‰，來源云南樣品的δ15N值范圍為-0.965‰～-0.190‰，來源于四川樣品的δ15N值范圍為0.055‰～0.280‰，來源于尼泊爾樣品的δ15N值為-3.106‰，亞香棒蟲草樣品的δ15N值范圍為-5.755‰～-3.160‰。

通過比對發現，不同地區冬蟲夏草的δ15N值波動范圍不同，除來源于青海海南州樣品(δ15N=-0.220‰)與云南省樣品δ15N值有重疊外，其他樣品均可按青海、四川、云南、尼泊爾等地理來源有效區分(圖1)，其中來源于玉樹和果洛的優質冬蟲夏草樣品與其他來源冬蟲夏草樣品的δ15N值波動范圍明顯不同，雙樣品t檢驗結果表明兩類樣品存在顯著差異(P＜0.009)(圖2);冬蟲夏草樣品與亞香棒蟲草樣品的δ15N值波動范圍差異尤為明顯，雙樣品t檢驗結果表明兩類樣品也存在顯著差異(P＜0.000 6)(圖3)。

圖1 不同來源樣品δ15N值的箱線圖Fig.2 Box plot of δ15N values from different samples

圖2 來源于玉樹和果洛的冬蟲夏草樣品與其他來源冬蟲夏草樣品的δ15N值箱線圖Fig.2 Box plot of δ15N values between samples from Yushu-Guoluo and other origins

圖3 冬蟲夏草樣品與亞香棒蟲草δ15N值的箱線圖Fig.3 Box plot of δ15N values between Ophicordyceps sinensis and Cordyceps hawkesii

2.2 冬蟲夏草C穩定同位素比值分析

12種不同來源冬蟲夏草樣品和3種亞香棒蟲草樣品的δ13C值測定結果見表1。其中來源于青海樣品的δ13C值范圍為-27.90‰～-25.95‰，來源云南樣品的δ13C值范圍為-27.01‰～-26.10‰，來源于四川樣品的 δ13C值范圍為 -27.6‰ ～-26.64‰，來源于尼泊爾樣品的 δ13C值為-28.34‰，亞香棒蟲草樣品的 δ13C值范圍為-28.23‰ ～ -27.42‰(表1)。

通過比對分析發現，不同地區冬蟲夏草的δ13C值波動范圍均較大重疊，無法有效區分，但冬蟲夏草δ13C值(-27.90‰ ～-25.95‰)和亞香棒蟲草(-28.23‰～-27.42‰)具有一定的差異(圖4)。

表1 冬蟲夏草樣品及δ15N測定結果Table 1 Ophicordyceps sinensis samples and δ15N values

圖4 不同來源樣品的δ13C值箱線圖Fig.4 Box plot of δ13C values from different samples

3 討論

本研究利用同位素比值質譜儀(IRMS)測定了來自我國青海、云南、四川以及尼泊爾的12個不同產區冬蟲夏草以及來自貴州省、江西省和湖南省的3種亞香棒蟲草的δ15N和δ13C值，數據統計分析結果顯示，不同地區冬蟲夏草的δ15N值波動范圍明顯不同，除來源于青海海南州的1個樣品外，其他樣品均可按青海、四川、云南、尼泊爾等地理來源有效區分;其中來源于青海玉樹、果洛的優質冬蟲夏草樣品與其他產地冬蟲夏草樣品存在顯著差異(P＜0.009);冬蟲夏草樣品與亞香棒蟲草樣品之間的差異尤為顯著(P＜0.000 6)。本研究是國內外首次將穩定同位素比值分析技術應用于冬蟲夏草產地鑒別的科研工作。

冬蟲夏草穩定同位素組成與產地的空氣密度、氣候、土壤和植被類型密切相關。冬蟲夏草主要生長于我國青藏高原及周邊地區海3 800～5 200 m的高寒草甸草皮層，生長環境十分特殊，其在生長成熟過程中不斷與外界環境進行物質交換。從冬蟲夏草侵染幼蟲到菌絲長滿幼蟲蟲體的整個過程中，蟲草處于土壤下，其體內物質組成受當地土壤與植被影響較大，待蟲草長出子座后與空氣直接接觸，又受到當地空氣、雨水等其他氣候因素的影響，冬蟲夏草體內穩定同位素受這些因素影響而發生自然分餾效應，導致不同產地冬蟲夏草體內同位素自然豐度的差異。

本研究中不同產地冬蟲夏草樣品的氮穩定同位素比值具有顯著差異，原因就在于不同產區的空氣、土壤和植被等與冬蟲夏草進行氮元素交換的主要客體，以及影響氮元素交換效率的雨水、風等氣候條件不同，引起不同來源的冬蟲夏草體內自然分餾效應的差異。植被是對冬蟲夏草碳穩定同位素比值影響最大的因素，冬蟲夏草寄主以植被根莖為主食，植被的碳同位素可通過食物鏈傳遞給蝙蝠蛾幼蟲，并在其體內代謝中進一步分餾，使其同位素組成有所變化［10］。冬蟲夏草均生長于高寒草甸上，植被類型大體相同，因而碳穩定同位素比值差異不明顯。但是，亞香棒蟲草生長于低海拔地區，其植被明顯不同于高海拔地區，這是其碳穩定同位素比值不同于冬蟲夏草的主要原因。

本研究所建立的氮穩定同位素比值分析技術方法能快速有效鑒別冬蟲夏草原產地，在冬蟲夏草與其相似品的鑒別中也有潛在的應用前景。但是，還需要進一步廣泛收集不同的蟲草測試樣品，獲得豐富的研究數據，并建立相應的數據信息系統，為將該技術方法應用于冬蟲夏草的原產地鑒別提供重要的參考依據。

［1］ 李進，馮成強，張文生.冬蟲夏草研究回顧與展望［J］.農業資源與環境科學，2008，24(2):382-384.

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