超聲輔助酶解-索氏提取聯用法提取馬齒莧籽油及其脂肪酸組成分析*

劉璐萍，謝翠品，岳麗，敬思群，蔡遠強，童蓮花

1(新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊，830046)

2(新疆源森康樂生物科技有限公司，新疆烏魯木齊，830013)

馬齒莧(Portulaca oleracea L.)是國家衛生部認定的藥食同源的野生植物之一［1-2］。馬齒莧及其籽中含有豐富的多不飽和脂肪酸［3］。多不飽和脂肪酸具有抑制血栓形成、防止動脈硬化、保護心血管等作用［4-6］。目前關于馬齒莧黃酮、生物堿、多糖等的研究較多［7-10］，但是對馬齒莧籽油的研究鮮見報道，使得絕大多數馬齒莧籽尚未開發利用。本研究以馬齒莧籽油提取率為考察指標，優化馬齒莧籽油的提取工藝并對其脂肪酸組成進行分析。

傳統的植物油脂提取主要有壓榨法、水蒸氣蒸餾法、溶劑浸提法等，新型的方法有超聲波輔助提取、生物酶法提取、超臨界CO2萃取法等［11-12］。其中，超聲波輔助提取法操作簡單，提取溫度低，提取率高;生物酶法不僅可以提高油脂質量，提高提油率，還可保持油料中組分不氧化，粕中蛋白不變性。盡管目前對超臨界CO2萃取技術提取油的工藝研究較多，但由于設備、能耗等多因素的限制，在實際生產中的應用有限;而且目前大多數的研究都集中在油脂的提取工藝，對提油前原料預處理的研究較少，為此，本實驗對馬齒莧籽采用超聲輔助酶解預處理得到最優預處理條件，再用傳統索氏提取法進行油脂提取。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及儀器

馬齒莧籽，新疆源森康樂生物科技有限公司;復合酶(中性蛋白酶、纖維素酶)，杰諾生物酶有限公司;石油醚，天津市永晟精細化工有限公司;一氯化碘、KI、環己烷、冰乙酸、NaOH等均為AR級;去離子水，實驗室自制。

HH-S型恒溫水浴鍋，鞏義市英峪予華有限公司;RE-52AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司;KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲輔助酶解-索氏提取聯用法提取馬齒莧籽油工藝流程

馬齒莧籽→粉碎→過篩(60目)→準確稱量→加水混勻→調pH值→超聲處理→加酶酶解→滅酶→冷凍→融解→烘干→濾紙包好裝入索氏提取器→石油醚回流提取→ 旋轉蒸發 →烘干→馬齒莧籽毛油

1.2.2 操作要點

(1)粉碎、過篩:用微型萬能粉碎機粉碎樣品，粒度控制在60目左右，貯藏備用。

(2)調pH值:調節pH值到所用復合酶的最適pH值。

(3)超聲處理:在超聲功率40 W，超聲溫度55℃條件下，超聲15 min。

(4)酶解:添加復合酶(中性蛋白酶∶纖維素酶=1∶1)，在一定添加量、溫度、pH下酶解2 h。

(5)滅酶:將酶解后的樣品在90℃下滅酶10 min。

(6)冷凍及融解:滅酶完成后，將酶解液置于超低溫冰箱中于-30℃下放置30 min，之后在室溫下融解。

(7)索氏提取:將已烘干的樣品裝入濾紙包并放入抽提筒中，加入1.67倍虹吸量的石油醚，調節水溫在55℃，使冷凝滴下的石油醚連成珠狀(回流7次/h以上)，抽提至抽取筒內的石油醚用濾紙點滴檢查無油跡為止(約需6 h)。

⑧旋轉蒸發:旋轉蒸發后回收溶劑，在103～105℃烘干恒重后，計算出馬齒莧籽油提取率。每組試驗平行做3次，結果取平均值。

1.2.3 馬齒莧籽油提取率的計算

式中:W，馬齒莧籽油的提取率，%;m1，提取馬齒莧籽油的質量，g;m2，稱取馬齒莧籽的質量，g。

1.2.4 超聲輔助酶解-索氏提取聯用法制備馬齒莧籽油單因素試驗

在液固比(mL∶g)為6∶1、pH 值7.0、酶解溫度55℃的條件下，考察纖維素酶的添加量對馬齒莧籽油提取率的影響;在 pH值7.0、纖維素酶的添加量為2%、酶解溫度55℃的條件下，考察液固比對馬齒莧籽油提取率的影響;在液固比(mL∶g)為5∶1、pH 值為7.0、纖維素酶的添加量為2%的條件下，考察酶解溫度對馬齒莧籽油提取率的影響;在液固比(mL∶g)為5∶1、纖維素酶的添加量為2%、酶解溫度60℃的條件下，考察pH值對馬齒莧籽油提取率的影響。

1.3 分析與測定

1.3.1 油脂的理化指標測定

過氧化值:參照文獻測定［13］;酸價:參照文獻測定［14］;碘價:參照文獻測定［15］;皂化價:參照文獻測定法［16］。

1.3.2 馬齒莧籽油脂肪酸組成GC-MS分析［17］

1.3.2.1 馬齒莧籽油甲酯化

采用KOH甲醇直接酯化法。分別稱取2種方法獲得的馬齒莧籽油0.25 g，置于10 mL試管中，加入石油醚∶乙醚(體積比4∶3)溶劑5 mL，振蕩溶解，再加入0.5 mol/L的KOH甲醇混勻溶液4 mL，振蕩1 min，在室溫下靜置30 min后，再加入1 mL蒸餾水，使全部有機相甲酯溶液升至瓶頸上部，澄清后吸取上清液用于GC-MS分析。

1.3.2.2 GC-MS實驗條件

GC條件:PEG-20M彈性石英毛細管柱，30 m×0.25 m×0.25 μm，載氣為氦氣，載氣流速為0.8 mL/min，程序升溫從180℃開始(保持2 min)，以3℃/min升溫到230℃，保持10 min，進樣口溫度250℃，出樣口溫度200℃，檢測電壓350 V。

因為我從兒子在那邊電話中的開心“哈哈”大笑聲中，看到的是那身體已經長大且已娶妻生子、實則心理始終沒有斷奶的兒子的愚蠢、無知、不懂事和毫無責任感。因為他根本不知道、不關心、不理解母親的真正快樂和幸福是什么，不是撫養了兒子又撫養孫子，照料了一個孫子又去照料第二個孫子，就是快樂和幸福。父母為子女辛勞、奉獻了一生，理應有自己晚年的生活內容與精神追求，而撫養孫子、奉養父母則應屬于做子女的責任和義務。可那兒子卻全然不知這些，真讓人可憐又可恨！

MS條件:EI離子源，電子能量70 eV，發射電流200 uA，掃描范圍20～550 amu，全離子掃描。

按GB/T17377-2008進行測定，用峰面積歸一化法確定了各組分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 水解馬齒莧籽酶種類的確定

當液固比(mL∶g)為6∶1，中性蛋白酶、纖維素酶及復合酶分別在各自最適的pH、溫度、相同的酶添加量/底物比條件下對馬齒莧籽作用相同的時間，馬齒莧籽油提取率見表1。

表1 不同酶的酶解條件和提取率Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of different enzymes and extraction rate

由表1可知，不經任何酶作用的對照組，馬齒莧籽油的提取率較低，只有71.17%。加入不同酶，馬齒莧籽油的提取率都得到明顯提高。由此可見，利用蛋白酶對蛋白質進行水解，破壞蛋白質結構，從而有利于油脂通道的打開，使油脂被釋放出來;利用纖維素酶降解植物細胞壁，使油脂容易游離出來，提高了馬齒莧籽油提取率。但是由于酶的專一性，采用單一酶在酶解工藝中有很大局限性，因此，選擇合適的復合酶，將會使細胞壁降解更徹底、效果更好。本實驗選擇纖維素酶與蛋白酶的復合酶，比單一酶的提油率有所提高，與傳統索氏提取法相比提高了15.22%。

2.2 超聲輔助酶解-索氏提取聯用法提取馬齒莧籽油的單因素試驗

2.2.1 酶的添加量對馬齒莧籽油提取率的影響

由圖1可知，馬齒莧籽油提取率隨酶用量的增加而增大。復合酶添加越多馬齒莧籽油提取率越高，其添加量達到2.0% 后，提高酶用量對提取率影響不大，當加酶量增加到2.5% 時，馬齒莧籽油提取率增加緩慢。因此，選擇酶的添加量為2.0%作為最適添加量。

圖1 酶的添加量對馬齒莧籽油提取率的影響Fig.1 Effects of the dosage of enzymes on extraction rate of seed oil

2.2.2 液固比對馬齒莧籽油提取率的影響

圖2 液固比對馬齒莧籽油提取率的影響Fig.2 Effects of the liquid to soild ratio on extraction rate of seed oil

2.2.3 酶解溫度對馬齒莧籽油提取率的影響

從圖3可知，在30～60℃內，馬齒莧籽油的提取率隨反應溫度的升高而增大，60℃時達到最大，高于60℃后，馬齒莧籽油的提取率呈下降的趨勢。說明實驗所用復合酶的最適溫度為60℃，低于或高于此溫度，將會影響酶反應效果。溫度為60℃時，馬齒莧籽油提取率最高，因此選定最適酶解溫度為60℃。

圖3 酶解溫度對馬齒莧籽油提取率的影響Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of seed oil

2.2.4 酶解pH對馬齒莧籽油提取率的影響

從圖4可知，馬齒莧籽油的提取率隨著酶解pH增大而增加，當pH值大于pH 5.0時提取率隨著pH值的增加而減小，pH 5.0時，提取率達到了最大，因為酶解pH影響酶活力，適當的pH值通過靜電作用，維持了酶活性中的最佳三維構象，促進酶與底物結合。所以最適pH值應為pH 5.0。

圖4 酶解pH對馬齒莧籽油提取率的影響Fig.4 Effects of enzymatic hydrolysis pH on extraction rate of seed oil

2.3 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選取酶解pH、酶解溫度以及液固比為試驗因素，以馬齒莧籽油提取率為實驗指標，設置四因素三水平試驗，選用L9(34)正交表進行試驗(結果見表2和表3)。每個試驗組合重復3次，結果取其平均值。用正交設計助手Ⅱv3.1.1統計軟件進行結果分析。

由表2可知，影響馬齒莧籽油提取率的因素順序為:液固比＞酶解pH＞酶解溫度。最優參數組合為A3B1C3D2，即液固比(mL∶g)6∶1，酶解溫度 50℃，酶解pH 6.0。根據最佳組合條件進一步做驗證試驗，得出馬齒莧籽油提取率為86.6%，與傳統索氏提取法相比提高了15.43%。提取率符合正交試驗中得到的結果，且結果重復性好，說明所選條件合理。由表3可知，超聲輔助酶解預處理中酶解溫度對馬齒莧籽油提取率的影響最小。液固比和酶解pH對提取率的影響顯著，酶解溫度對提取率的影響不顯著。

表2 正交試驗結果表Table 2 Orthogonal experiments result

表3 對提取率的方差分析表Table 3 Variance analysis of the extraction rate

2.4 提油方法效果比較

2.4.1 兩種方法制備油的理化性質比較

由表4可知，不同的方法對所提油脂的氣味、滋味和色澤無顯著影響，但超聲輔助酶解-索氏提取聯用法所得馬齒莧籽油的酸價、過氧化值均低于索氏提取法，說明在超聲輔助酶解預處理馬齒莧籽的過程中可能降解了部分影響油脂品質的雜質，相對保護了馬齒莧籽油的品質。

2.4.2 兩種方法制備油的GC-MS結果比較

從表5可以看出，馬齒莧籽油含有8種不飽和脂肪酸，占脂肪酸總量的85.98%左右。超聲輔助酶解-索氏提取聯用法所得馬齒莧籽油的ω-3脂肪酸含量高達40.26%，其次為亞油酸 29.43%和油酸15.61%。2種方法制備的馬齒莧籽油的脂肪酸成分基本一致，但超聲輔助酶解-索氏提取聯用法同索氏提取法相比，前有所得油的亞油酸含量略高，而油酸含量要略低，且馬齒莧籽油提取率高。

表4 兩種方法制備的馬齒莧籽油的理化性質比較Table 4 Comparison of physical and chemical properties in seed oils obtained by two methods respectively

表5 兩種方法制備的馬齒莧籽油的脂肪酸組成比較Table 5 Comparison of the fatty acid composition in seed oils obtained by two methods respectively

3 結論

超聲輔助酶解預處理馬齒莧籽的最優條件為:復合酶添加量2%，液固比(mL∶g)6∶1，酶解溫度50℃，酶解pH6.0，在索氏提取馬齒莧籽油的最優工藝條件(55℃，6 h)下，馬齒莧籽油提取率可達86.8%，與傳統索氏提取法相比提高了15.43%。2種方法制備的馬齒莧籽油的脂肪酸成分基本一致，但超聲輔助酶解-索氏提取聯用法所得馬齒莧籽油的不飽和脂肪酸含量高于索氏提取法，且前者所提馬齒莧籽油的酸價、過氧化值均低于后者所得馬齒莧籽油。由此可知，超聲輔助酶解-索氏提取聯用法優于索氏提取法。

［1］ 王紅艷，王松麗，黃群策.野生蔬菜馬齒莧的研究進展［J］.中國農學通報，2004，4(2)∶31-36.

［2］ 遼寧省科學技術協會.遼寧山野菜栽培新技術［M］.沈陽:遼寧科學技術出版社，2008.

［3］ 劉鵬巖，郭志峰，安秋榮，等.馬齒莧及其籽中脂肪酸的比較研究［J］.分析測試學報，1995，14(5)∶70-72.

［4］ Burr G O，Burr M M.On the nature and role of the fatty acids essential innutrition［J］.J Biol Chem，1999(86)∶587-621.

［5］ LONG Jing-jing，FU Yu-jie.Ultrasound-assisted extraction of flaxseed oil using immobilized enzymes［J］.Bioresource Technology，2011，9(102)∶991-996.

［6］ 張寶著，胡小戈.保健蔬菜—馬齒莧［J］.食品研究與開發，200021(3):21-23.

［7］ 盧新華，關章順，何軍山，等.馬齒莧抗氧化有效成分的研究［J］.上海中醫藥大學學報，2004，18(1)∶56-58.

［8］ 王仲英，李香蘭，宣春生.馬齒莧總生物堿的測定［J］.太原理工大學學報，2001，32(2)∶197-198.

［9］ 王莉，劉志勇，魯建江，等.微波技術輔助測定馬齒莧中總黃酮和多糖的含量［J］.食品工業科技，2002，23(5):70.

［10］ 謝曉鳳，童蓮花，童德勝，等.馬齒莧總黃酮的提取及其濃縮汁抗氧化性研究［J］.食品科技，2013(2)∶192-197.

［11］ 吳彩娥.獼猴桃籽油α-亞麻酸的富集及獼猴桃籽油微膠囊化技術研究［D］.楊凌:西北農林科技大學，2005.

［12］ 張志軍，劉西亮，李會珍，等.植物揮發油提取方法及應用研究進展［J］.中國糧油學報，2011，2(4)∶118-122.

［13］ GB/T 5538-2005.植物油脂檢驗，過氧化值測定法測定［S］.

［14］ GB/T 5530-2005.動植物油脂檢驗，酸價和酸度測定［S］.

［15］ GB/T 5532-2008.植物油脂檢驗，碘價測定［S］.

［16］ GB/T 5534-2008.植物油脂檢驗，皂化價測定［S］.

［17］ GB/T 17377-2008.動植物油脂脂肪酸甲酯的氣相色譜分析［S］.