3種殺菌方式對蛋清液功能特性及蛋白結構的影響*

范金波，侯宇，王瑞環，周素珍，呂長鑫，馮敘橋

1(渤海大學食品科學研究院遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州，121013)

2(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京，100083)

高密度CO2(DPCD)、高壓脈沖電場(PEF)都是非熱食品加工的重要方法，它們都能殺死致病菌、腐敗微生物以及鈍化酶類物質，因而能保藏食品。與傳統熱殺菌方法相比，由于排除了熱引起的食品成分及風味物質的變化，因而能較好地保存食品原有的營養價值和風味、口感等［1］。國外對于這2種非熱殺菌研究較多，尤其是高壓脈沖電場方面，而我國對此的研究起步晚，且大多研究都只是針對非熱殺菌處理對食品中的微生物和酶的影響方面，對非熱殺菌處理對食品功能性質的影響研究較少。蛋清液具有良好的起泡、乳化等功能性質，在食品工業中占據重要地位，而熱處理以及非熱殺菌處理對蛋清液這些功能性質及蛋白結構的影響研究尚不夠深入，本研究評價了DPCD、PEF和熱處理對蛋清蛋白的溶解性、起泡性、乳化性等功能性質以及表面疏水性和蛋白質聚集等結構特征的影響，以期對這3種殺菌方法在蛋液殺菌中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所有雞蛋均來自北農大集團前一天所產雞蛋。牛血清蛋白購自北京鼎國生物技術有限責任公司;8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEM)均購于Sigma公司。

WBN-5/50二氧化碳高密度滅菌機，溫州貝諾機械有限公司;S10手提式高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司;JSM-6510LV掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社;RF-5301 PC熒光分光光度計，日本島津Shimadzu公司;UV-2102 PC型紫外可見分光光度計，美國UNIC尤尼柯公司;DK-8B恒溫水浴鍋，上海市精宏實驗設備有限公司;ALC-2100.2型電子天平，Acculab公司;pH211型pH酸度計，HANNA公司;HWS型恒溫恒濕培養箱，寧波江南儀器廠;DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司;3K30高速離心機，美國Sigma公司;實驗中使用的PEF殺菌試驗裝置為中國農業大學食品科學與營養工程學院教育部果蔬加工工程研究中心與清華大學自主研發設計。PEF參數設置:脈沖寬度5 μs;脈沖頻率16 Hz;處理腔間距0.4 cm;處理室個數2;流速0.2 mL/cm。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋清液的制備

將蛋殼完整無損的雞蛋在自來水中清洗干凈，室溫下晾干后，用酒精棉擦試蛋殼表面，然后打蛋，濾蛋器小心分離蛋黃，用電動攪拌器攪拌均勻，得到蛋清液。

1.2.2 分別采用3種殺菌方式處理蛋清液

DPCD殺菌:首先開啟冷卻器和恒溫水浴使其達到設定溫度。之后，開啟水浴循環使處理釜達到30℃，接著將樣品放入處理釜中，完全密封后開啟增壓泵泵入CO2，在處理釜內形成高密度CO2處理環境，維持恒定的壓力(35 MPa)和溫度，處理60 min后卸壓取出樣品。

脈沖電場殺菌:PEF電場強度E和處理時間t的計算:

式中:U，實際電壓，kV;電極板間距，0.4 cm;n，處理室個數;V，處理腔體積，0.05 mL;f，頻率，Hz;W，脈寬，μs;v，流速，mL/s。電壓強度采用10 kV。

熱處理殺菌:蛋清液的熱處理過程采用模擬工業上巴氏殺菌的方法。將蛋清液裝在內徑11.5 mm的玻璃試管中，每管裝10 mL蛋清液，為確保無微生物污染，試管提前滅菌。先將蛋清液經45℃預熱10 min后在60℃保持3.5 min。

1.2.3 紫外光譜法測蛋白質含量

以牛血清蛋白為標準物，測其在280 nm(A280)的紫外光譜吸收［2-3］。稱取50 mg牛血清蛋白配制成50 mL的溶液，然后用蒸餾水稀釋至質量濃度為0.1、0.2、0.3……0.9 mg/mL，以蒸餾水為對照，測定其在280 nm下的分光光度值。繪制標準曲線，吸光度與牛血清蛋白濃度的線性關系為:y=0.648x+0.030(R2=0.998)。將處理前后的蛋清液離心后稀釋100倍，以蒸餾水為對照，測A280值，根據標準曲線計算其蛋白含量。

1.2.4 溶解性的測定［4］

將處理前后的蛋清液于10 000 r/min，4℃下離心10 min，取上清液測定蛋白質含量。蛋清蛋白的溶解度計算:

1.2.5 起泡性及起泡穩定性的測定

根據Sathe等［5］使用的方法，用去離子水將處理前后的蛋清液稀釋到蛋白質濃度為2%，取100 mL稀釋液250 mL燒杯中，用高速分散器以10 000 r/min的轉速分散2 min。記錄分散停止時和停止后30 min的泡沫體積數為V1及 V2，起泡性(FC)與泡沫穩定性(FS)計算:

1.2.6 乳化性及乳化穩定性的測定

根據Yao等［6］提出的蛋白質乳化性的測定方法，并稍作修改:分別取0.1 mL處理前后的蛋清液加入到50 mL去離子水中，混勻，按照體積比1∶3向蛋白液中加入花生油，最終制成180 mL的混合液，用高速分散器以10 000 r/min的轉速分散1 min，從底部抽取樣品液50 μL，并按體積比1∶100稀釋到質量濃度0.1%的SDS溶液中，并測其在500 nm下的吸光值A0。測定乳化性后的乳液在80℃水浴加熱30 min，冷卻至室溫，搖勻，記錄其在500 nm下的吸光值A1，乳化性(EC)與乳化穩定性(ES)計算:

1.2.7 表面疏水性測定

采用8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)作熒光探針。其中ANS溶液是采用10 mmol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液配制成濃度為8 mmol/L的溶液。將樣品用10 mmol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液分別稀釋至蛋白質量濃度在0.10～0.50 mg/mL。采用RF-5301PC熒光分光光度計，在390 nm的激發波長下測定樣品的熒光強度(FI0)，在470 nm的發射波長下測定樣品加入10 μL ANS溶液后的熒光強度(FI1)，FI1和 FI0的差值記為FI，以蛋白質濃度為橫坐標，FI為縱坐標作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數，記為S0。

1.2.8 凝膠結構掃描電鏡(SEM)觀察

參考趙偉［4］使用的蛋清凝膠結構掃描電鏡觀察，將一定量處理前后的蛋清液放入50 mL燒杯中，85℃水浴加熱30 min后迅速放入冰水浴中冷卻，在4℃下放置24 h，取出陳化30 min，從凝膠不同部分切3～5 mm的小立方體，在常溫下用3%的戊二醛磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.0)固定2 h。用冷緩沖液漂洗3次，每次20 min。接著在4℃下用1%的四氧化鋨的磷酸鹽緩沖液進行再次固定1.5 h，用緩沖液漂洗3次，每次20 min。分別采用體積分數30%，50%，70%，95%乙醇溶液梯度脫水，最后用無水乙醇漂洗3次，醋酸異戊酯過渡。之后樣品用臨界點干燥儀干燥，以離子濺射儀噴金，最后用JSM-6510LV掃描電子顯微鏡進行觀測。

2 結果與分析

2.1 三種殺菌方式對蛋清蛋白溶解性的影響

蛋清蛋白的溶解性是蛋清蛋白重要功能性質之一，直接影響蛋清的其它功能特性，如起泡、乳化和增稠作用。蛋白質的溶解度是在蛋白質-蛋白質和蛋白質-溶劑相互作用之間熱力學平衡的結果。

如圖1所示，經PEF處理使蛋清蛋白的溶解度降低了5%左右，經DPCD處理過的蛋清蛋白溶解度降低了30%，而熱處理能使蛋清蛋白的溶解度大幅增加，與新鮮蛋清液相比，經熱處理過的蛋清蛋白溶解度提高了45%。Zhao等［7］研究發現，PEF處理會引起蛋清蛋白溶解度的下降，而且下降幅度受電場強度和時間的影響，PEF處理800 μs后蛋清蛋白的溶解度下降了6%，本研究結論與其相符。

圖1 DPCD、PEF以及熱處理對蛋清蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of DPCD，PEF and heat treatment on the solubility of egg white protein

2.2 三種殺菌方式對蛋清蛋白起泡性能的影響

空氣隨著蛋清的攪打而進入蛋液形成泡沫，隨著泡沫數目的增多，氣泡逐漸變小，直到最后失去流動性，然后加熱使之固定，蛋清的這種特性在很多食品如奶油蛋糕中得到應用。

如圖2所示，經熱處理后蛋清蛋白的起泡性明顯降低。PEF處理使蛋清液的起泡性和泡沫穩定性分別提高了12%和44%，主要是由于在低電場強度的作用下蛋清蛋白結構受到輕微改變，致使蛋白結構展開，因此有利于其發揮起泡性能［8-9］。DPCD處理使蛋白結構改變劇烈，蛋白質分子展開后相互作用，形成聚集體，最終導致不溶性蛋白質沉淀，蛋白質溶解度降低，致使起泡性大幅降低。

2.3 三種殺菌方式對蛋清蛋白乳化性能的影響

蛋白質具有乳化性是因為蛋白質具有兩親結構，分子中同時含有親油性基團和親水性基團。在油水混合液中，蛋白質有擴散到油-水界面的趨勢，并且使疏水部位展開朝向脂質，極性部分朝向水相，蛋白質分子聚集于油-水界面，表面張力下降，促進脂肪和水形成油-水乳化液。而后，乳化的油滴被聚集在其表面的蛋白質所穩定，形成一種保護層，該保護層可以防止油滴的聚積和乳化狀態的破壞，這就是通常所說的蛋白質的乳化性［10］。

圖2 DPCD、PEF以及熱處理對蛋清液起泡性能的影響Fig.2 Effect of DPCD，PEF and heat treatment on the forming properties of egg white liquid

根據圖3所示，經DPCD處理后，蛋清蛋白的乳化性大大降低，PEF處理后蛋清液的乳化性提高了40%，而熱處理則使蛋清液的乳化性降低了7%，主要是因為2種處理方式造成的蛋清蛋白變性程度不同。蛋白質輕微變性時，可使蛋白質分子結構舒展而又不會使其溶解度降低太多，疏水基團外露致使蛋白質分子的表面疏水性增加，此時蛋白質的乳化能力增強;當蛋白質變性程度增大，舒展的蛋白質分子通過疏水作用和二硫鍵的交互作用形成大的蛋白質聚集體，甚至形成沉淀，此時蛋白質的乳化能力降低。

圖3 DPCD、PEF以及熱處理對蛋清液乳化性能的影響Fig.3 Effect of DPCD，PEF and heat treatment on the emulsifying properties of egg white liquid

2.4 三種殺菌方式對蛋清蛋白表面疏水性的影響

疏水相互作用對蛋白質的功能性質及其結構的穩定具有重要的作用，是維持蛋白質三級結構的主要作用力。疏水性的氨基酸殘基一般位于蛋白質分子內部，當蛋白質分子受到較強的外部作用力時如高溫、高壓，蛋白質結構舒展，致使疏水基團外露。因此，可以用蛋白質的表面疏水特性評價蛋白質結構的改變［11］。對蛋清液分別進行DPCD、PEF及熱處理后應用ANS熒光探針法測定蛋白質的表面疏水性，ANS熒光探針法是評價蛋白質表面疏水性的一種經典方法，可以在一定程度上反映出水溶液中蛋白質的三級結構。ANS與芳香族氨基酸在390 nm激發波長下結合，并在470 nm處有最大吸收，且熒光強度與蛋白的表面疏水性成正相關［12］。

圖4為3種處理作用對蛋清蛋白表面疏水性的影響。由圖4可以得出，這3種處理方式均能使得蛋清蛋白的表面疏水性有不同程度的增強，其中熱處理對其影響最大，使疏水性跟對照相比增加近1倍。這一結果表明，這3種處理使蛋清蛋白的結構發生改變，導致疏水基團外露，因此處理后的蛋白質分子表面疏水性增強。當外露的疏水基團增加到一定程度時，蛋白質分子間發生疏水相互作用，發生“疏水塌陷”，由此蛋白質表面疏水性下降，從而形成蛋白質聚集［4］。

2.5 三種殺菌方式對蛋清液凝膠結構的影響

圖4 DPCD、PEF和熱處理分別作用對蛋清蛋白表面疏水性的影響Fig.4 Effect of DPCD，PEF and heat treatment on surface hydrophobicity of egg white protein

圖5顯示了4組蛋清蛋白凝膠掃描電鏡對比圖，未經處理的蛋清蛋白(圖5A)凝膠結構致密、空隙小，分布均勻。DPCD處理(圖5B)的蛋清蛋白凝膠結構變化最為顯著，與原蛋清蛋白凝膠結構相比，經DPCD處理后，凝膠結構變成稀疏多孔的顆粒狀態，有一定的團簇狀態，說明DPCD處理對蛋白凝膠結構影響顯著。PEF處理后，蛋清蛋白凝膠結構變得粗糙和無序，說明PEF處理對蛋清蛋白凝膠結構有一定影響(圖5C)。熱處理(圖5D)的蛋清蛋白凝膠結構變化明顯，變得更加致密疏松，600倍掃描電鏡下觀察，有不均勻的空穴，這主要是因為蛋清蛋白經熱處理后產生了較大程度聚集，大粒徑的顆粒增多后發生交聯，形成了致密的凝膠結構。

圖5 DPCD、PEF和熱處理蛋清蛋白凝膠結構SEM圖Fig.5 SEM micrographs of gels from egg white treated by DPCD，PEF and heat treatment

3 結論

本文研究了經DPCD、PEF和熱處理對蛋清蛋白的溶解性、起泡性、乳化性等功能性質以及結構特征的影響，結果表明:DPCD處理使蛋清蛋白的溶解度降低了30%，使其起泡性及泡沫穩定性、乳化性及乳化穩定性大幅降低;PEF處理使蛋清蛋白的溶解度降低了5%左右，提高蛋清液的起泡性和泡沫穩定性分別為12%和44%，使蛋清液的乳化性提高了40%;熱處理使得蛋清蛋白溶解度提高了45%，但蛋清蛋白的起泡性明顯降低。蛋清液分別經DPCD、PEF和熱處理后，蛋清蛋白的結構發生改變，蛋白質部分變性，導致疏水基團外露，表面疏水性有不同程度的增強，其中熱處理對其影響最大。熱處理發生的蛋白聚集程度要大于DPCD處理對蛋清蛋白的影響，PEF處理對蛋清蛋白的影響最輕微。因此，綜合以上結果，PEF處理的綜合效果要好于其他2種處理。

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