2010～2011年四川省部分地區牛乳生產鏈金黃色葡萄球菌及其腸毒素基因的分布*

韓新鋒，凡琴，劉書亮，2，朱冬梅，2，賴海梅，2，吳聰明3，

1(四川農業大學食品學院，四川 雅安，625014)

2(農產品加工及貯藏工程四川省重點實驗室，四川雅安，625014)

3(中國農業大學動物醫學院，北京，100193)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)廣泛存在于自然界，是引起食物中毒的重要致病菌，在美國、加拿大和中國引起的金黃色葡萄球菌食物中毒分別占整個細菌性食物中毒的33%、45%和50%［1］，由此造成的經濟損失也相當慘重。金黃色葡萄球菌能產生多種外毒素，其中，以耐熱性腸毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)引起的食物中毒最為普遍，已成為世界性衛生問題，包括中國在內的許多國家都將金黃色葡萄球菌腸毒素作為國內和國家進出口食品微生物必檢指標之一。金黃色葡萄球菌腸毒素是一類結構相關、毒力相似、抗原性不同的外毒素，迄今已發現十幾種金黃色葡萄球菌腸毒素并定位其基因，主要包括以下幾種類型，即傳統類型的SEA、SEB、SEC、SED和 SEE，新型的 SEG、SEH、SEI和 SEJ等［2］。引發的食物中毒95%與分型中的A、B、C、D及E型腸毒素相關［3］，其中A型和D型占主導地位，B型、C型次之，E型的出現率最低，各腸毒素毒力不一，A型毒素毒力較強，D 型較弱［4-5］。

乳及乳制品營養成分比較完全，含有豐富的蛋白質，是易被金黃色葡萄球菌污染的主要動物性食品之一［6］。奶牛乳腺炎疾病是生鮮牛乳金黃色葡萄球菌一次污染的最主要原因，此外，生鮮牛乳擠出后，由于罐裝、貯藏、運輸、消毒等條件不合格亦會造成金黃色葡萄球菌的二次污染［7-8］。近些年來，國內外關于乳及乳制品中金黃色葡萄球菌污染、產腸毒素特性報道增多，分離株多攜帶腸毒素基因。乳及其成品中金黃色葡萄球菌及其腸毒素的存在已對食品安全構成嚴重威脅。本文旨在調查四川乳品生產鏈中金黃色葡萄球菌的污染情況，分析分離株中最常見引起食物中毒的4種腸毒素基因的攜帶情況，為食源性金黃色葡萄球菌風險評估以及乳品生產中HACCP的建立提供依據。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

2010年4月至2011年6月從四川省部分牛乳生產企業采集生鮮牛乳693份，生產車間半成品牛乳112份，成品牛乳88份，合計893份。

1.2 實驗菌株

金黃色葡萄球菌7147(SEA陽性)、X1(SEB陽性)、B4(SEC陽性)、C8(SED陽性)，作為SEs基因檢測的陽性菌株。大腸桿菌ATCC25922、藤黃微球菌ATCC10209、腸炎沙門氏菌 C1CC21482，用于 SEs基因檢測陰性對照，由四川農業大學食品微生物實驗室保存。

1.3 培養基

7.5 %氯化鈉肉湯、Baird-Parker(B-P)瓊脂培養基、金黃色葡萄球菌顯色培養基、凍干兔血漿、卵黃亞碲酸鉀增菌液購自杭州微生物試劑有限公司。金黃色葡萄球菌產毒培養基，購自青島高科園海博生物技術有限公司。無菌脫纖維兔血購自成都奧克生物技術有限公司。

1.4 主要試劑

GoldViewTMDNA 染料、DL 2000 DNA Marker、溶菌酶購自天根生化科技(北京)有限公司。Taq DNA聚合酶、10 ×PCR buffer、dNTP mixture(2.5 mmol/L)、MgCl2(25 mmol/L)購自寶生物工程(大連)有限公司。TIANamp Bacteria DNA Kit提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.5 金黃色葡萄球菌的分離、鑒定

采集的樣品按照國家標準GB/T 4789.10—2010《食品微生物學檢驗——金黃色葡萄球菌檢驗》進行檢驗。具體方法如下:樣品經7.5%氯化鈉肉湯增菌培養，B-P平板分離純化、選取B-P平板上疑似菌落再次劃線于B-P平板直至分純，對純化菌株進行革蘭氏染色鏡檢、溶血試驗、血漿凝固酶試驗及科瑪嘉顯色試驗，分離鑒定出金黃色葡萄球菌。陽性菌株加入終濃度為20%的甘油，-20℃保存。

1.6 多重PCR檢測SEs基因及16S rDNA

檢測的腸毒素基因分別為SEA、SEB、SEC、SED，16S rDNA為內參基因，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

表1 引物序列及產物大小［9-10］Table 1 Primer sequences and predicted sizes of PCR product for the amplification of S.aureus target genes

利用多重PCR對126株金黃色葡萄球菌的腸毒素基因攜帶情況進行檢測。首先將菌株接種于5 mL LB肉湯，37℃培養24 h，收獲菌體，采用 TIANamp Bacteria DNA Kit提取試劑盒提取細菌基因組DNA，-20℃保存備用。將菌株7147、X1、B4基因組 DNA按1∶1∶1混合制成 SEA、SEB、SEC 陽性模板，-20℃保存備用。

多重PCR檢測腸毒素基因的反應系統經優化后采用2個擴增體系。PCR反應體系1(用于SEA、SEB、SEC 基因的檢測):10 ×PCR buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)4 μL，dNTPmixture(2.5 mmol/L)2 μL，DNA 模板 2 μL，SEA(10 μmol/L)、SEB(10 μmol/L)、SEC(10 μmol/L)引物各 0.75μL，Taq DNA 聚合酶(1.25 U)2 μL，滅菌超純水加至 50 μL。

PCR反應體系2(用于SED基因的檢測):10×PCR buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)4 μL，dNTP mixture(2.5 mmol/L)2 μL，DNA 模板 2 μL，SED(10 μmol/L)引物 0.75 μL、16S rDNA 引物(10 μmol/L)0.15 μL，Taq DNA 聚合酶(1.25 U)2 μL，滅菌超純水加至 50 μL。

兩個體系的PCR反應條件均為:94℃，10 min;之后 95℃，1 min，62℃，45 s，72℃，1 min，進行 30 個循環;最后72℃延伸10 min。吸取2 μL PCR擴增產物上樣于2%瓊脂糖凝膠(0.5×TBE)，80 V電壓電泳30 min后，置于凝膠成像系統中觀察、拍照，分析電泳結果。

2 結果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌分離株的形態特征

金黃色葡萄球菌在B-P瓊脂平板上菌落呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤，直徑1 mm左右，灰黑至黑色，有光澤，有淺色(非白色)的邊緣，周圍繞以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰帶，其直徑為3～5mm;在血瓊脂平板上菌落呈金黃色或白色，周圍有溶血圈;在科瑪嘉顯色平板上呈紅色或粉紅色;革蘭氏染色顯示，金黃色葡萄球菌為無芽孢、無莢膜成對或成堆排列的葡萄狀G+球菌(圖1)。

2.2 金黃色葡萄球菌分離株的生化鑒定結果

893份牛乳樣品經增菌、分離培養和接觸酶試驗后，參照GB/4789.10-2010對純化菌株進行革蘭氏染色鏡檢、溶血及血漿凝固酶試驗，將純化分離株點種于科瑪嘉顯色培養基觀察顯色試驗結果，共分離出191株金黃色葡萄球菌菌株(表2)。

圖1 金黃色葡萄球菌的菌落特征及個體形態特征Fig.1 Colony and individual morphous characteristics of S.aureus

表2 乳品生產鏈中金黃色葡萄球菌的鑒定結果Table 2 Phenotypic identification results of S.aureus in the milk production chain

2.3 金黃色葡萄球菌的污染情況

牛乳生產鏈各個環節金黃色葡萄球菌總檢出率為21.4%(191株)，生鮮牛乳、車間半成品牛乳和成品牛乳的檢出率分別為26.4%(183株)、7.1%(8株)及0.0%(0株)。

2.4 SEs基因的多重PCR檢測結果

2.4.1 腸毒素基因多重PCR檢測結果

通過優化反應條件所建立的多重PCR方法針對SEA、SEB、SEC基因可在同一體系同時特異性地擴增出3條目的條帶，片段大小分別為521 bp、667 bp和284 bp。針對SED和內參基因16S rDNA可在同一體系同時特異性地擴增出2條目的條帶，大小分別為385bp和228 bp，表明所建立的多重PCR方法檢測金黃色葡萄球菌的腸毒素基因準確、可靠(圖2)。

2.4.2 SEA、SEB、SEC基因多重PCR檢測結果

圖2 多重PCR檢測金黃色葡萄球菌腸毒素基因和16S rDNA的特異性試驗結果Fig.2 Multiplex PCR results for the amplification of enterotoxin genes and 16s rDNA of S.aureus

來自不同生產環節的121株金黃色葡萄球菌有16株攜帶SEA基因，13株攜帶SEB基因，7株攜帶SEC基因，以上菌株均為生鮮牛乳源。半成品牛乳樣品中未檢測出腸毒素基因攜帶菌株(圖3)。

圖3 多重PCR檢測牛乳生產鏈中部分金黃色葡萄球菌分離株SEA、SEB和SEC腸毒素基因電泳圖Fig.3 Examples of multiplex PCR results for the detection of SEA，SEB，SEC genes of S.aureus isolates

2.4.3 SED及16S rDNA目標片段PCR鑒定

不同生產環節的121株金黃色葡萄球菌有4株攜帶SED基因，且均為生鮮牛乳源;所有菌株均可擴增出16S rDNA基因片段(圖4)。

圖4 多重PCR檢測牛乳生產鏈中部分金黃色葡萄球菌分離株SED腸毒素基因和16S rDNA電泳圖Fig.4 Examples of multiplex PCR results for the detection of SED gene and 16S rDNA of S.aureus isolates

2.5 各型腸毒素基因檢出率統計

121株金黃色葡萄球菌腸毒素基因總檢出率為22.3%(27株)，生鮮牛乳源、中間過程乳源及成品乳源菌株腸毒素基因攜帶率分別為23.9%(27株)、0.0%(0株)及0.0%(0株)。不同生產環節的121株金黃色葡萄球菌單一SEA、SEB、SEC、SED基因檢出率分別為 9.0%(11株)、4.1%(5株)、0.8%(1株)及0.8%(1株)。同時攜帶SEA-SEB、SEB-SEC、SEA-SED、SEA-SEB-SEC、SEB-SEC-SED 基因的菌株檢出率分別為1.6%(2株)、1.6%(2株)、0.8%(1株)、1.6%(2株)、1.6%(2 株)。各分型 SEA、SEB、SEC、SED基因的總檢出率分別為13.2%(16株)、10.7%(13株)、5.8%(7 株)、3.3%(4 株)，生鮮牛乳源金黃色葡萄球菌各分型SEA、SEB、SEC、SED基因的總檢出率與整體差異不大，分別為14.2%(16株)、11.5%(13 株)、6.2%(7 株)、3.5%(4 株);車間半成品牛乳和成品牛乳未檢出攜帶 SEA、SEB、SEC、SED基因的金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌分離株攜帶的腸毒素基因總的情況為，分離株中SEA、SEB基因的存在比例較高，其它依次是SEC和SED基因。

3 討論

國家標準將血漿凝固酶試驗作為金黃色葡萄球菌判定的重要依據，但一些非金黃色葡萄球菌可以產生活性較大的蛋白酶(假凝固酶)使結果出現假陽性。本試驗在國家標準的基礎上，加做了金黃色葡萄球菌的科瑪嘉顯色試驗，進一步提高了金黃色葡萄球菌表型檢測結果的準確性。16S rDNA是細菌鑒定、分類的“金標準”。在多重PCR體系2中，所建立的多重PCR能夠對金黃色葡萄球菌SED基因和保守序列同時進行鑒定，結果顯示金黃色葡萄球菌分離株16S rDNA基因鑒定結果與表型鑒定的符合率為100.0%。

采用國標方法檢測四川省部分乳品企業牛乳生產鏈中金黃色葡萄球菌的污染情況顯示，金黃色葡萄球菌的總檢出率是21.4%，其中，生鮮牛乳的檢出率最高，為 26.4%，與 Normanno(38.4%)［4］、徐勤(15.20%)［11］、Lee(29.6%)［12］等的報道有所不同，表明生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌的污染情況存在地區差異。易明梅［7］認為飼養和擠奶等環節牛體衛生消毒不徹底會導致奶牛相互之間金黃色葡萄球菌交叉污染致病;胡東良［13］對采集的340份生鮮乳進行檢測，發現混裝奶桶(罐)生鮮乳的金黃色葡萄球菌污染率(58.8%)高于奶牛個體(39.0%)。值得注意的是，雖然牛乳在生產過程中通過超高溫瞬時殺菌(UHT)或巴氏殺菌，可以殺死牛乳中絕大多數病原微生物，但是如果原料乳中存在的金黃色葡萄球菌在合適條件下產生腸毒素，由于其具有高度的熱穩定性，不能通過熱力殺菌消除，依然會對乳品的質量安全帶來隱患。因此，要減少金黃色葡萄球菌對生鮮牛乳的污染，除降低奶牛乳腺炎疾病的患病率和淘汰患化膿性乳腺炎的奶牛外，還應及時將擠出的乳迅速冷至10℃以下，定期對奶罐、奶車、牛奶貯藏罐及生產環境進行消毒。隨著生產鏈的延伸，半成品牛乳及成品牛乳的污染率降低至7.1%和0.0%，與Normanno［4］、Can［14］、張蘭榮［15］等報道結果基本一致。為防止食物中毒事件的發生，必須高度重視乳制品的金黃色葡萄球菌及其腸毒素的監測，加強對原料牛乳的監控，嚴格控制生產工藝流程中各個可能污染環節，重視對包裝材料的消毒，避免成品牛乳受外界因素的影響而再次污染，保障產品檢驗合格方可出廠。

金黃色葡萄球菌新型腸毒素的檢出比例日益增多，腸毒素蛋白純化以及特異性抗體的制備難度較大，使得ELISA方法在腸毒素檢測及腸毒素分型中應用的局限性越來越明顯。用PCR技術監測食品中金黃色葡萄球菌及其腸毒素基因或對其進行分型具有特異性好、靈敏度高、節約時間的特點，具有良好的應用前景。Peles等［8］利用多重PCR技術檢測發現27.1%牛奶源金黃色葡萄球菌攜帶SEs基因，其中以SEB基因最普遍;Pereira等［9］利用多重PCR對148株食源性金黃色葡萄球菌檢測發現69%的分離株攜帶 SEs基因，其中以 SEA-SEG、SEA-SEG-SEI、SEGSEI基因攜帶菌株最為普遍;張嚴峻等［16］對生鮮牛乳源金黃色葡萄球菌的腸毒素基因檢測發現，65.5%的菌株攜帶腸毒素基因，其中51.7%的菌株攜帶SEA基因，17.2%的菌株攜帶其他傳統腸毒素基因(SEB～SEE)，41.2%的菌株攜帶新型腸毒素基因(SEG～SEJ)。本研究中22.3%(27株)的菌株攜帶一種及多種腸毒素基因，低于上述報道，以SEA基因的攜帶率最高，為13.2%，其次為SEB基因，SED基因的攜帶率最低，說明SEA在金黃色葡萄球菌引起的食物中毒中占有重要地位，與國外SEB基因在牛乳源金黃色葡萄球菌中分布比例較高［2，8］或SEA基因最高、SED其次［17］的研究結果存在差異，這可能與分離株地域、宿主差異等不同有關。處于生產鏈不同環節的分離株腸毒素基因分布情況有很大差異，生鮮牛乳中腸毒素基因攜帶菌株檢出率為23.9%，車間半成品牛乳和成品牛乳未檢測出腸毒素基因攜帶菌株。

有研究表明，腸毒素編碼基因常出現在質粒、原噬菌體、毒力島上，在一個獨立單元上，它們可同時攜帶一種或多種腸毒素基因，如SEB-SElK-SElQ存在于毒力島 SaPI1上，SEC-SElL-txt存在于毒力島 SaPI2上，SEC-SElL存在于毒力島SaPI3上，SEA由噬菌體φSa3mu攜帶，SED 由質粒 PIB485攜帶［18］。因此，同一株菌可同時攜帶兩種或兩種以上的腸毒素基因，且不同基因型的檢出率與菌株有一定的關聯度。曹虹等［19］認為各腸毒素型之間關系最為密切的是SEA與SEC，Akindden等［20］發現患乳房炎奶牛產的牛奶中分離的腸毒素基因SED和SEJ基因的檢出呈完全的連鎖關系。本文所分離的9株生鮮牛乳源金黃色葡萄球菌攜帶有多種腸毒素基因型(SEA-SEB 2株;SEB-SEC 2株;SEA-SED 1株;SEA-SEB-SEC 2株;SEB-SEC-SED 2株)，且不同基因型的檢出率與菌株具有一定的關聯性。各腸毒素分型間關系最為密切的是SEB和SEC基因(6株同時攜帶SEB和SEC基因)，其次為SEA和SEB(4株同時攜帶SEA和SEB基因)，觀察發現，SEC與SEA、SEC及SED的出現也呈現一定的連鎖關系。

本文研究了四川地區乳品生產加工環節中金黃色葡萄球菌的污染情況，分析了乳品生產鏈中金黃色葡萄球菌分離株腸毒素基因的分布規律，為乳及其制品中由腸毒素引起的食源性疾病的暴發提供了監測、追蹤依據，為食品安全監管提供了數據支持。

［1］ 蔣原.食源性病源微生物檢測指南［M］.北京:中國標準出版社，2010:98-109.

［2］ Boerema JA，Clemens R，Brightwell G.Evaluation of molecular methods to determine enterotoxigenic status and molecular genotype of bovine，ovine，human and food isolates of Staphylococcus aureus［J］.International Journal of Food Microbiology，2006，107(2):192-201.

［3］ Cremonesi P，Luzzana M，Brasca M，et al.Development of a multiplex PCR assay for the identification of Staphylococcus aureus enterotoxinic strains from milk and dairy products［J］.Molecular Cell Probes，2005，19(5):299-305.

［4］ Normanno G，Firinu A，Virgilio S，et al.Coagulase-positive Staphylococci and Staphylococcus aureus in food products marketed in Italy ［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，98(1):73-79.

［5］ Lawrynowicz-Paciorek M，Kochman M，Piekarska K，et al.The distribution of enterotoxin and enterotoxin-like genes in Staphylococcus aureus strains isolated from nasal carriers and food samples ［J］.International Journal of Food Microbiology，2007，117(3):319-323.

［6］ Jakobsen RA，Heggebo R，Sunde EB，et al.Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in Norwegian raw milk cheese production［J］.Food Microbiology，2011，28(3):492-496.

［7］ 易明梅.上海地區牛奶乳房炎主要致病菌分析及基因治療初探［D］.上海:上海交通大學，2008.

［8］ Peles F，Wagner M，Varga L，et al.Characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine milk in Hungary［J］.Journal of Clinical Microbiology，2007，118(2):186-193.

［9］ Pereira V，Lopes C，Castro A，et al.Characterization for enterotoxin production，virulence factors，and antibiotic susceptibility of Staphylococcus aureus isolates from various foods in Portugal［J］.Food Microbiology，2009，26(3):278-282.

［10］ L?vseth A，Loncarevic S，Berdal KG.Modified multiplex PCR method for detection of pyrogenic exotoxin genes in Staphylococcal isolates［J］.Journal of Clinical Microbiology，2004，42(8):3869-3872.

［11］ 徐勤，巢國祥.生牛奶中金黃色葡萄球菌污染狀況及耐藥性狀研究［J］.中國衛生檢驗雜志，2005，15(8):972-973.

［12］ Lee JH.Methicillin(oxacillin)-resistant Staphylococcus aureus strains isolated from major food animals and their potential transmission to humans［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69(11):6489-6494.

［13］ 胡東良，林雁春，劉佩紅，等.乳及乳制品中金黃色葡萄球菌的分布及其理化特性研究［J］.食品科學，1996，17(4):69-73.

［14］ Can H Y，Celik T H.Detection of enterotoxigenic and antimicrobial resistant S.aureus in Turkish cheeses［J］.Food Control，2012，24(1-2):100-103.

［15］ 張蘭榮，王連秀，張文利.食品中金黃色葡萄球菌的污染狀況及耐藥性分析［J］.中國食品衛生雜志，2004，16(1):35-36.

［16］ 張嚴峻，張俊彥，梅玲玲，等.金黃色葡萄球菌腸毒素基因的分型和分布［J］.中國食品衛生雜志，2005，15(6):682-684.

［17］ Morandi S，Brasca M，Lodi R，et al.Detection of classical enterotoxins and identification of enterotoxin genes in Staphylococcus aureus from milk and dairy products［J］.Veterinary Microbiology，2007，124(1-2):66-72.

［18］ Argudín M á，Mendoza MC，Rodicio MR.Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins ［J］.Toxins，2010，2(7):1 751-1 773.

［19］ 曹虹，王敏，鄭榮，等.金黃色葡萄球菌臨床分離株腸毒素基因的調查分析［J］.南方醫科大學學報，2012，32(5):738-745.

［20］ Akineden O，Annermuller C，Hasson A A，et al.Toxin genes and other characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis［J］.Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，2001，8(5):959-964.