腐爛蘋果中嗜酸耐熱菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)的分離鑒定及生長特性的初步研究*

馬麗達，陳義倫，孫文靜，魏然，吳茂玉，和法濤

(山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)

酸土脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)，俗稱嗜酸耐熱菌［1］，易污染果汁產品，一般認為該菌來源于土壤［2］，通過落果、爛果、果皮、已感染的加工車間設備等傳染到加工果汁中，并在加工過程中繁殖，以芽孢的形式耐受果汁加工過程中的巴氏殺菌，一旦遇到合適的萌發環境即大量繁殖代謝產生愈創木酚和鹵酚，使得果汁口感風味變差，濁度升高乃至在包裝物底部形成白色沉淀［3］。研究表明，酸土脂環酸芽孢桿菌是導致蘋果汁酸敗的主要菌種［4］。該菌在低污染時難以檢出，產品流通及腐敗時才會被發現［5］。

本研究以金帥腐爛果為材料，在分離嗜酸耐熱菌并對其進行形態、生理生化及16S rDNA區鑒定的基礎上，對其生長特性進行初步探索，以期為進一步完善嗜酸耐熱菌的控制方法，提高蘋果汁加工安全性提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

金帥蘋果:自然腐爛蘋果。

標準菌:CICC 10374(=DSM 3922=ATCC 49025)由中國工業微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養基

(1)402 培養基:CaCl20.19 g，MgSO40.5 g，(NH4)2SO40.20 g，KH2PO43.0 g，酵母浸膏 2.0 g，葡萄糖 5.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 4.0。

(2)K氏培養基:酵母浸膏2.5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖 1 g，吐溫80 1 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 4.0。

(3)LB培養基:酵母浸膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl10 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。

(4)PDA斜面培養基:馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 4.0。

1.1.3 儀器與設備

PB-10pH計，Sartorius公司;電子顯微鏡YSZ-H，日本尼康光學儀器有限公司;PCR儀，Biometra Tcradient;凝膠成像系統，Upland.CA.USA;電泳儀DYY-8C，北京市六一儀器廠;數顯恒溫水浴鍋 HH-I，國華電器有限公司

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的分離、純化與篩選

(1)菌種分離:挑取金帥蘋果的腐爛部分，勻漿;稱取10 g勻漿，加入90 mL無菌水進行懸浮;45℃、180 r/min 下振蕩培養 30min，制成 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的稀釋液，分別吸取 100 μL 涂布于402培養基上，45℃倒置培養3～4 d。挑取402培養基上生長的菌落形態類似于標準菌的疑似菌落，劃線接種于LB平板上，45℃培養48 h，保留不能在LB平板上生長，但能在402培養基上生長的菌株，從而篩選出只能在酸性條件下生長的嗜酸菌株。將由此篩選出的嗜酸菌制成菌懸液;將此菌懸液在80℃條件下熱處理10 min［6］，取0.1 mL菌液涂布于402培養基上，45℃培養48 h，觀察是否有菌落出現，此時生長的菌種即為嗜酸耐熱菌。

(2)菌種純化:將分離得到的嗜酸耐熱菌菌株在K氏培養基上進行平板劃線純化，45℃恒溫條件下培養。按此方法連續劃線，直至單個平板上為形態單一的菌落。挑取平板上的單菌落進行純培養，得到純菌株。

(3)菌種保藏:將純菌株接種于PDA斜面培養基上培養24 h，4℃保藏備用。

1.2.2 菌種鑒定

(1)菌落形態及顯微形態觀察:將所得的菌種在K氏培養基上劃線，進行菌落(形態，顏色，大小，邊緣整齊度，透明度，黏稠度等)和顯微鏡觀察。

(2)生理生化鑒定:根據《常見細菌系統鑒定手冊》與《伯杰細菌鑒定手冊》［7-8］對得到的細菌進行生理生化鑒定。主要指標包括碳源利用、氧化酶試驗、接觸酶試驗、V-P試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、吲哚試驗、脲酶試驗。

(3)分子生物學鑒定

a.DNA的提取。將菌種接種在K氏液體培養基中，45℃，180 r/min搖床培養14 h，然后用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的DNA。

b.PCR擴增。擴增使用的上游引物為27F，下游引物為1492R。

27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3＇;

1492R:5＇-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3＇。

PCR擴增的反應體系為50 μL，其中10×buffer 5 μL;Mg2+3 μL;dNTP 4 μL;引物各 1 μL;Taq 酶 0.4 μL;模板2 μL;雙蒸水補足到 50 μL。PCR 擴增的反應條件為:95℃預變性5 min，94℃變性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，進行35個循環，最后72℃保溫10 min。4℃保藏。

將PCR擴增產物送華大測序公司進行測序。測序結果在軟件DNAMAN上進行拼接，拼接結果在NCBI上進行BLAST比對，構建系統發育樹。

1.2.3 生長特性的研究

(1)生長曲線的繪制:將各菌株的活化液分別接種在K氏液體培養基中，45℃、180 r/min搖床培養。并于接種后的第 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 和24 h，以未接種菌種的空白K氏液體培養基作為空白，取菌液于1 cm比色杯利用分光光度計測定600 nm處的吸光度，繪制出各菌株的生長曲線。

(2)溫度對菌株生長的影響:將各菌株接種在K氏液體培養基中在不同的溫度(20、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃)條件下進行搖瓶培養，45℃、180 r/min搖瓶培養16 h后，以未接種菌種的空白K氏液體培養基作為空白，取菌液于1 cm比色杯利用分光光度計測定600 nm處的吸光度，得出菌株在不同溫度條件下的生長情況。

(3)pH對菌株生長的影響:將各菌株在不同pH值(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)的K氏液體培養基中進行搖瓶培養，45℃、180 r/min搖瓶培養16 h后，以未接種菌種的空白K氏液體培養基作為空白，取菌液于1 cm比色杯利用分光光度計測定600 nm處的吸光度，得出菌株在不同pH條件下的生長情況。

(4)芽孢耐熱性:參考焦中高［9］的方法，將芽孢懸液稀釋至105～106CFU/mL，然后置于90℃水浴中處理，分別取一定量的處理懸液稀釋涂平板，40℃培養3 d后計數。以處理時間為橫坐標、存活芽孢數的對數為縱坐標進行線性回歸，作芽孢存活曲線，計算D90℃值。D90℃值即該菌株芽孢在90℃處理時存活曲線斜率的負倒數。

2 結果與分析

2.1 嗜酸耐熱菌的確定

從腐爛蘋果中通過分離、篩選及純化，最終得到2株嗜酸耐熱菌，即分離菌A-1和分離菌A-2，如圖1與圖2所示。

圖1 A-1菌落形態圖Fig.1 Colonial morphology of strain A-1

圖2 A-2菌落形態圖Fig.2 Colonial morphology of strain A-2

A-1、A-2經過 80℃、10 min的熱處理，均可在402培養基上生長良好，表明有很好的耐熱性;另外均可在K氏培養基上生長良好，但在LB培養基上不能生長，表明2株分離菌具有耐酸性，初步確定A-1、A-2均為嗜酸耐熱菌。

2.2 形態學鑒定

經形態學觀察(圖1-圖4)可知，2株分離菌與標準菌的菌落形態特征及顯微形態特征十分相似，其形態描述如表1。

圖3 A-1革蘭氏染色圖Fig.3 Micrograph of strain A-1 by Gram stain

圖4 A-2革蘭氏染色圖Fig.4 Micrograph of strain A-2 by Gram stain

表1 形態學特征Table 1 Morphological characteristics

2.3 生理生化鑒定

分離菌A-1、A-2進行生理生化試驗的結果如表2所示。A-2氧化酶呈陰性，A-1的肌醇利用呈陰性，其他生理生化指標均與標準菌相同，同種微生物不同菌株間可能存在特性的差異，分離菌與標準菌仍具有同屬脂環酸芽孢桿菌屬的可能性。

表2 生理生化鑒定結果Table 2 Results of physiological and biochemical identification

通過對菌種的形態觀察和生理生化鑒定，可以得知2株分離菌與標準菌的各項指標相似，初步認為2株分離菌均屬于脂環酸芽孢桿菌屬。對分離的2株菌進行分子生物學分類鑒定，進一步確定其分類地位。

2.4 分子生物學鑒定

2.4.1 序列比對結果

利用細菌試劑盒提取2株分離菌的DNA，電泳檢測后進行PCR擴增，將PCR擴增產物進行測序。分離菌的DNA及PCR產物電泳圖見圖5，由圖5可知，PCR產物擴增之后得到的序列長度均在1 500 bp左右。

圖5 DNA及PCR產物電泳圖Fig.5 DNA electrophoresis and PCR product electrophoresis

2.4.2 系統發育樹的構建

PCR產物測序結果在DNAMAN上進行拼接，并在GENEBANK上進行BLAST比對，挑選同源性超過99%的基因序列構建系統發育樹(見圖6)。由系統發育樹可知，該菌與酸土脂環酸芽孢桿菌的同源性可達到100%，結合形態鑒定和生理生化鑒定結果，最終鑒定A-1、A-2均為酸土脂環酸芽孢桿菌。

圖6 分離菌A-1與A-2的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of isolated strains A-1 and A-2

2.5 生長特性的研究

2.5.1 生長曲線的繪制

由圖7可知，A-1與標準菌的生長趨勢大致相同，均在4h時由延遲期進入對數生長期，8 h時進入穩定生長期;當生長到16 h之后菌體濁度緩慢降低。而A-2生長速度較快，培養14 h之后營養物質消耗殆盡，菌體濁度緩慢降低。

圖7 菌株生長曲線Fig.7 Growth curves of standard and isolated strains

2.5.2 溫度對菌株生長的影響

菌株分別在不同溫度下培養16 h，測定OD600。由圖8可以看出，A-1、A-2均可在一個相對廣泛的溫度范圍內生長。當pH為4.0時，溫度為45℃，A-1、A-2菌體濁度最高，長勢最好，可確定為A-1、A-2的最適生長溫度。

Wisotzkey［10］提出細胞膜中獨特的ω-環己烷脂肪酸結構為脂環酸芽孢桿菌在酸熱環境中的生長提供有利條件。ω-環己烷脂肪酸作為細胞的保護結構，有助于提高細菌處于高溫環境和酸性條件的適應能力和生存能力。目前脂環酸芽孢桿菌的耐熱機制尚不明確，仍需進一步的深入研究與探討。

2.5.3 pH值對菌株生長的影響

圖8 溫度對菌株生長的影響Fig.8 Effect of temperature on strain growth

菌株在不同pH值條件下分別培養16 h，測定OD600。由圖9可以看出，A-1、A-2生長的pH范圍為2.5～6.5。當pH值為3.5時，A-2菌體濁度最高，長勢最好，為A-2的最適生長pH值。當pH值為4.0時，A-1菌體濁度最高，長勢最好，為A-1的最適生長pH值。

圖9 pH值對菌株生長的影響Fig.9 Effect of pH on strain growth

從2株分離菌的生長pH值范圍和最適生長pH可以看出，分離菌表現出了對酸性條件的嗜好性，能較好的耐受酸性條件。因此，只有在酸性條件下該菌才適宜生長繁殖。

2.5.4 芽孢耐熱性的研究

嗜酸耐熱菌芽孢90℃熱處理，其存活曲線如圖10所示。A-1、A-2的 D90℃分別為11.90 min和13.70 min。A-2的芽孢表現出了比標準菌(D90℃約為13.33 min)更強的耐熱性。

圖10 芽孢存活曲線Fig.10 Survival curves of spores

嗜酸耐熱菌的耐熱性主要體現在芽孢上。在蘋果汁加工過程中，巴氏殺菌或高溫瞬時滅菌并不能使其芽孢失活，反而刺激了芽孢的萌發。待條件適宜時芽孢可在蘋果汁中大量繁殖最終導致蘋果汁的腐敗。

3 結論

(1)本次實驗經形態學特征、生理生化特性驗證得到了2株與標準菌A.acidoterrestris CICC 10374具有明顯相似性的嗜酸耐熱菌A-1與A-2，經16S rDNA序列比對并構建系統發育樹，分離菌與A.acidoterrestris同源性可達100%，最終分離菌A-1、A-2均鑒定為酸土脂環酸芽孢桿菌。

(2)從腐爛的金帥蘋果中分離到的酸土脂環酸芽孢桿菌A-1、A-2的最適生長溫度均為45℃(pH值為4.0)，最適生長pH值分別為4.0、3.5。90℃熱處理其芽孢，A-1、A-2的D90℃分別為11.90 min和13.70 min，A-2比A-1、標準菌有更強的耐熱性，A-2可作為蘋果汁加工過程品質控制的主要對象進一步研究。

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