鰱魚魚鱗膠原蛋白的流變特性

熊文飛，陳日春，，蔡一楠，鄭寶東

1(福州市食品工業研究所，福建 福州，350013)2(福建農林大學食品科學學院，福建福州，350002)

膠原蛋白是動物皮、骨和肌腱等結締組織中主要的結構蛋白，由于其具有很好的生物兼容性與降解性以及較弱的抗原性而被廣泛應用于食品、藥品和化妝品行業［1］。通常膠原蛋白都是從牛、豬以及家禽等陸生動物的加工副產物中提取，然而隨著瘋牛病、口蹄疫以及禽流感的爆發，引起了一些消費者對來自于陸生動物膠原蛋白及其相關制品的擔憂，因此水產品作為一種新的膠原蛋白來源而被日益重視。

一般情況下，膠原蛋白都是以液體試劑的形式存在，膠原溶液一方面可以作為組織填充物［2］或藥物載體而直接注射［3］，另一方面也可轉化成諸如纖維、薄膜、海綿以及生物膜等形式的固體植入物［4-5］。無論膠原蛋白以何種形式應用，對其流變學特性的研究均非常重要，因為對膠原蛋白流變特性的認識能夠幫助生產者控制或操縱相關膠原產品質量的優劣與穩定性［6］。國內外針對膠原蛋白流變特性的研究，先后有Amis等［7］分別通過對水和甘油中膠原蛋白黏度的測量研究了pH對其彈性的影響;Yoshimura等［8］探究了鯊魚皮堿溶性與酶溶性膠原蛋白黏度特性的動力機制;Forgacs等［9］通過對膠原蛋白流變性的測定研究了膠原基質組件的溶膠-凝膠相轉變;Lai等［10］系統地研究了牛皮膠原蛋白溶液的流變學特性，結果表明牛皮膠原蛋白為典型的假塑性流體;王海波等［11］研究了草魚魚鱗酸溶與酶溶性膠原蛋白的流變特性。本文以鰱魚魚鱗膠原蛋白為研究對象，重點考察剪切速率、濃度、溫度等因素對其流體特性和黏彈性的影響，旨在為鰱魚魚鱗膠原蛋白的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

鰱魚魚鱗收集于福州市華林永輝超市，魚鱗經冷水反復沖洗后低溫風干保存于-18℃下備用;EDTA，由汕頭市金砂化工廠有限公司提供;胃蛋白酶(1∶3 000)，由上海源聚生物科技有限公司提供;透析袋(截留分子量10 kDa)，由上海源葉生物科技有限公司提供;其他化學劑均為分析純。

1.2 主要設備

AR1140電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;H2050R臺式高速大容量冷凍離心機，湘儀離心機有限公司;LGJ-10D冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠;NDJ-8S數字式黏度計，上海尼潤智能科技有限公司;MCR30高級流變儀，奧地利安東帕公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膠原蛋白的提取

新鮮魚鱗用冰純水清洗除雜后，用EDTA溶液浸泡脫鈣［12］，料液比(g∶mL)1∶30;脫鈣后的魚鱗于 0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡6 h脫除非膠原蛋白，料液比(g∶mL)1∶8;將經脫鈣和除去非膠原蛋白后的魚鱗浸泡于0.5 mol/L乙酸溶液中，添加0.85%胃蛋白酶，液料比(g∶mL)1∶18，提取膠原蛋白;經 300 目濾布過濾得到膠原蛋白提取液，向提取液中添加NaCl至其濃度達0.9 mol/L，鹽析24 h，然后離心獲得膠原蛋白沉淀物，將沉淀物置于截留分子質量為10 kDa的透析袋中透析24 h，凍干即得膠原蛋白備用。

1.3.2 剪切速率對膠原蛋白溶液黏度的影響

剪切速率對膠原蛋白溶液流體特性的影響參考汪海波等［11］的方法略作修改。用蒸餾水配制不同質量濃度(0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%)的膠原蛋白溶液，采用MCR30高級流變儀測定溶液在不同剪切速率下不同溶液的黏度，測定條件:溫度20℃，椎板40 mm，2°，測定采用流動模式，數據獲取為連續模式，以剪切速率為變量，變量范圍從1～1 000 s-1，變量掃描為線性模式，采集30個變量點。

1.3.3 溫度對膠原蛋白溶液黏度的影響

用蒸餾水配制質量濃度為1.0%的膠原蛋白溶液，采用NDJ-8S數字式黏度計不同溫度下不同濃度膠原蛋白溶液的黏度，測定條件為:零號轉子，轉速30 r/min，測定溫度范圍10～70℃，每隔5℃測定1次。

1.4 鰱魚魚鱗膠原蛋白溶液的黏彈性能

1.4.1 膠原蛋白溶液黏彈曲線的測定

膠原蛋白溶液黏彈曲線的測定參考Lai等［10］的方法略作修改。用蒸餾水配制質量濃度為1.0%的膠原蛋白溶液，采用MCR30高級流變儀測定其黏彈性曲線。測定條件:溫度20℃，40 mm，2°椎板，在振蕩模式下測定，采用頻率掃描的數據獲取模式，頻率掃描范圍從150～0.01rad/s，變量掃描為線性模式，采集30個變量點。

1.4.2 溫度對膠原蛋白溶液黏彈性能的影響

溫度對膠原蛋白溶液黏彈性能的影響參考Lai等［10］的方法略作修改。用蒸餾水配制質量濃度為1.0%的PSC溶液，采用MCR30高級流變儀測定其粘彈性曲線。測定條件:40 mm，2°椎板，平衡時間1 min，振蕩測定模式，采集30個變量點，溫度掃描范圍從10～70℃，振蕩頻率為60 rad/s，數據獲取模式為溫度掃描模式。

1.5 統計分析

采用Origin8.0和DPS7.05分別對試驗結果進行繪圖和擬合。

2 結果與分析

2.1 剪切速率對膠原蛋白溶液黏度的影響

蛋白質溶液的黏度反映了它對流動的阻力，可用牛頓冪律方程來表示:

式中:η為表觀黏度，Pa·s;k為濃度系數;γ為剪切速率，s-1;n為流動指數。

當n=1時，流體為牛頓流體;當n≠1時，流體為非牛頓流體，其中n＞1時，流體為脹塑性流體;n＜1時，流體為假塑性流體。

剪切速率對鰱魚魚鱗膠原蛋白溶液黏度的影響如圖1所示。由圖可知，隨著膠原蛋白質量濃度的提高，其表觀黏度也相應上升;當剪切速率較低時，表觀黏度下降迅速，而表觀黏度在較高剪切速率下下降緩慢，表觀黏度隨剪切速率的增加而降低的現象在流變學中稱為剪切稀釋。造成剪切稀釋的原因主要是由于蛋白質分子在流動方向上逐步定向，因而摩擦阻力下降，另外蛋白質水化球在流動方向變性以及氫鍵和其他弱鍵的斷裂導致蛋白質聚集體或網絡結構的解體也會導致剪切稀釋的發生［13］。剪切稀釋現象是典型非牛頓流體特有的假塑性流動行為，表明不同質量濃度的膠原蛋白溶液均為假塑性流體，這與草魚魚鱗膠原蛋白［11］和牛皮膠原蛋白［10］的流體類型相同。

圖1 剪切速率對膠原蛋白溶液粘度的影響Fig.1 Effect of shear rate on the viscosity of collagen solution

進一步對圖1中曲線進行擬合，得到回歸方程和相關系數如表1所示。由表1可知，各回歸方程中n＜1，這進一步驗證了膠原蛋白溶液為假塑性流體。隨著膠原蛋白質量濃度的增加，回歸方程中濃度系數和流動指數均呈現出上升趨勢，且在高剪切速率下，膠原蛋白溶液有從假塑性非牛頓流體變為牛頓流體的趨勢。此外各回歸方程的相關系數均大于0.950 0，說明擬合值與實測值吻合很好，回歸方程有效。

表1 不同濃度膠原蛋白溶液的牛頓冪律方程Table 1 Newtonian power-law equation of different collagen solution

2.2 溫度對膠原蛋白溶液黏度的影響

溫度對鰱魚魚鱗膠原蛋白溶液(1.0%)黏度的影響如圖2所示。隨著溫度的上升，膠原蛋白溶液表觀粘度持續下降;相比較而言，溫度較低時表觀黏度的下降更為迅速;當溫度由20℃上升到25℃過程中，表觀黏度出現了一個驟然下降的突變段，這是由于膠原蛋白受熱變性所致。

圖2 溫度對膠原蛋白溶液黏度的影響Fig.2 Effect of temperature on the viscosity of collagen solution

溫度對流體溶液黏度的影響可用阿羅尼烏斯方程方程來描述:

式中:η為溶液表觀黏度;k為常數;Ea為活化能;R為氣體常數;T絕對溫度，K。

采用DPS7.05數據分析軟件對試驗結果進行分段擬合和回歸分析，結果如表2所示。活化能隨著溫度的增加而逐漸上升，這說明隨著溫度的增加，膠原蛋白溶液流動所需要的能量增加。且各回歸方程的相關系數R均大于0.910 0，說明擬合值與實測值吻合很好，回歸方程有效。

表2 膠原蛋白溶液的阿羅尼烏斯方程Table 2 Arrhenius equation of collagen solution

2.3 膠原蛋白溶液黏彈曲線的測定

通常用振蕩模型來測定高聚物的黏彈性能，即對高聚物分子施加一個扭擺力矩，使高聚物在此力矩下發生運動。高聚物的黏彈性能可用Maxwell力學模型來描述:

式中:G*為動態模量或絕對模量，Pa;G＇為儲存模量或彈性模量，Pa;G″為損耗模量或黏性模量，Pa。

其中G＇反映了高聚物隨外力的改變而發生形變的能力，而G″則反映了高聚物在外力作用發生改變時分子鏈內部或分子間拉伸導致的能量損耗。高聚物在振蕩運動中的力學損耗可用正切損耗角 tanδ隨振蕩頻率變化的改變來表示［14］:

鰱魚魚鱗膠原蛋白溶液(1.0%)的黏彈曲線如圖3所示。當振蕩頻率小于20 rad/s時，黏性模量G″大于彈性模量G＇，tanδ大于1，膠原蛋白溶液主要表現為黏性行為;當振蕩頻率大于20 rad/s時，黏性模量G″小于彈性模量G＇，tanδ小于1，膠原蛋白溶液主要表現為彈性行為。這與草魚魚鱗膠原蛋白在整個振蕩頻率范圍內主要表現為黏性行為(tanδ大于1)，基本不具備凝膠的彈性特征不同［11］。

圖3 膠原蛋白溶液黏彈曲線(20℃，1.0%)Fig.3 Visco-elastic curve of collagen solution(20℃，1.0%)

2.4 溫度對膠原蛋白溶液黏彈性能的影響

溫度對鰱魚魚鱗膠原蛋白溶液黏彈性能的影響如圖4所示。

圖4 溫度對膠原蛋白溶液(1.0%)黏彈曲線的影響Fig.4 Effect of temperature on the visco-elastic curve of collagen solution(1.0%)

從圖4可以看出，在膠原蛋白變性溫度附近，膠原蛋白溶液的彈性模量G'和黏性模量G″均出現突躍現象;而在經過變性溫度區間之后，彈性模量G'基本保持不變，黏性模量G″逐漸下降，這表明鰱魚魚鱗膠原蛋白發生熱變性之后，其流體的彈性行為基本不變而黏性行為下降，這與草魚魚鱗膠原蛋白受溫度的影響結果略有不同［11］。

3 結論

鰱魚魚鱗膠原蛋白溶液為典型假塑性流體，即溶液黏度隨剪切速率的增加而減小，且其流變特性均符合牛頓冪律方程。剪切速率、濃度和溫度對膠原蛋白溶液的黏度影響較大，且阿羅尼烏斯方程能夠很好地表達溫度對黏度影響。當振蕩頻率小于20 rad/s時，鰱魚魚鱗膠原蛋白溶液(1.0%)主要表現為黏性行為;當振蕩頻率大于20 rad/s時，鰱魚魚鱗膠原蛋白溶液(1.0%)主要表現為彈性行為。溫度對鰱魚魚鱗膠原蛋白溶液(1.0%)黏彈性能的影響顯著，膠原蛋白發生熱變性之后，其流體的彈性行為基本不變而黏性行為下降。

［1］ Liu W T，Li G Y，Miao Y Q，et al.Preparation and characterization of pepsin-solubilized type I collagen from the scales of snakehead(Ophiocephalus argus)［J］.Journal of Food Biochemistry，2009，33(1):20-37.

［2］ de Paula M，Goissis G，Martins V C A，et al.Injectable gels of anionic collagen:rhamsan composites for plastic correction:preparation，characterization，and rheological properties［J］.Journal of Biomedical Materials Research Part B:Applied Biomaterials，2005，75(2):393-399.

［3］ Friess W.Collagen-biomaterial for drug delivery［J］.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，1998，45(2):113-136.

［4］ Friess W.Collagen-biomaterial for drug delivery［J］.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，1998，45(2):113-136.

［5］ Friess W，Schlapp M.Effects of processing conditions on the rheological behavior of collagen dispersions［J］.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2001，51(3):259-265.

［6］ Kao N，Bhattacharya S N，Shanks R，et al.The effect of temperature on the viscoelastic properties of model and industrial dispersions［J］.Journal of Rheology，1998，42(3):493-506.

［7］ Amis E J，Carriere C J，Ferry J D，et al.Effect of pH on collagen flexibility determined from dilute solution viscoelastic measurements［J］.International Journal of Biological Macromolecules，1985，7(3):130-134.

［8］ Yoshimura K，Chonan Y，Shirai K.Preparation and dynamic viscoelastic characterization of pepsin-solubilized collagen from shark skin compared with pig skin［J］.Animal Science Journal，1999，70(4):227-234.

［9］ Forgacs G，Newman S A，Hinner B，et al.Assembly of collagen matrices as a phase transition revealed by structural and rheologic studies［J］.Biophysical Journal，2003，84(2):1 272-1 280.

［10］ Lai G，Li Y，Li G.Effect of concentration and temperature on the rheological behavior of collagen solution［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2008，42(3):285-291.

［11］ 汪海波，王孟津，張寒俊，等.草魚魚鱗膠原蛋白的流變學性能研究［J］.食品科學，2009，30(23):138-142.

［12］ 陳日春.鰱魚魚鱗的脫鈣工藝［J］.農產品加工·學刊，2013(2):42-44.

［13］ 闞建全.食品化學［M］.北京:中國農業大學出版社，2002:171.

［14］ 何曼君.高分子物理［M］.上海:復旦大學出版社，2000:261-292.