植物乳桿菌增殖培養及其濃縮型凍干發酵劑的制備*

吳滿剛，莊濤，王小蘭，吳雪燕，陳洋洋，于海，葛慶豐，汪志君

(揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州，225127)

真空冷凍干燥法制備凍干發酵劑是將需要保藏的微生物細胞懸浮液凍結后，在真空條件下使冰升華，最終達到干燥的目的［1］。此方法主要是根據微生物生理、生化特點，干燥后微生物的代謝緩慢、生長繁殖受到抑制，達到休眠狀態，從而保持菌株原有特性。凍干發酵劑主要優點是:活菌含量高、保藏期長、發酵性能穩定、易于運輸等，在西方發達國家已得到廣泛應用［2］。凍干發酵劑的制備工藝大致可分為3步:增殖培養、收集濃縮和冷凍干燥［3］。

現有報道［4］發酵香腸中的乳酸菌以彎曲乳桿菌、植物乳桿菌、清酒乳桿菌和短小乳桿菌為主。Stahnke［5］報道，植物乳桿菌大多情況下為優勢菌，少數情況下清酒乳桿菌占優勢，乳酸菌生長不一致可能與香腸配方和發酵條件不同有關。戊糖片球菌、清酒乳桿菌最能適應發酵香腸的制作環境，短小乳桿菌不能適應特定的環境，后期生長較慢，植物乳桿菌最適宜作為乳酸菌發酵劑用于香腸生產。本試驗以植物乳桿菌為目標菌株，通過增殖培養，再濃縮收集后篩選凍干保護劑，從而最大限度地提高菌體存活率，旨在為研制高效凍干發酵劑提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料和設備

1.1.1 主要材料

脫脂乳、番茄、胡蘿卜、平菇，均為市售優質產品。

濃H2SO2、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、碘化汞、硫酸銨、磺基水楊酸等均為分析純;酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖等均為生化試劑。

菌種:L2植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。

1.1.2 培養基

(1)MRS 液體培養基［6］。

(2)脫脂乳培養基:脫脂奶粉加蒸餾水制成濃度為14%的脫脂乳液，115℃，滅菌10 min，冷卻后使用。

(3)各種增殖培養基:在MRS液體培養基基礎上添加不同生長因子。

番茄汁：新鮮番茄→清洗→熱燙(90～95℃，3～5 min)→榨汁→過濾→定容(500 g制成1 L番茄汁)→調pH 6.4→過濾除菌備用。

玉米汁：玉米粉→稱重→加水煮沸10 min→過濾→定容(500 g制成1 L玉米汁)→調pH 6.4→過濾除菌備用。

胡蘿卜汁：新鮮胡蘿卜→洗凈→去皮及根梢→稱重→切片→加水煮沸10 min→榨汁→過濾→定容(500 g制成1 L胡蘿卜汁)→調pH 6.4→過濾除菌備用。

平菇汁：新鮮平菇→洗凈→去根→稱重→切片→加水煮沸10 min→榨汁→過濾→定容(500 g制成1 L平菇汁)→調pH 6.4→過濾除菌備用［7-8］。

1.1.3 儀器和設備

EPS300電泳儀，上海UNICO公司;高速冷凍離心機:5804R，北京艾澤信科技有限公司;KDN-04A蛋白質測定儀，上海貝特儀電設備廠;WFJ2000分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;75 μm Car/PDMS復合式萃取頭，美國Supelco公司;Trace氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)，美國Finnigan公司;755S紫外-可見分光光度計，上海棱光技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化

將植物乳桿菌活化2次，以3%接種量將活化液接入裝有100 mL MRS液體培養基的250 mL三角瓶中，35℃搖床培養24 h備用。

1.2.2 植物乳桿菌增殖因子的單因素試驗

獲得乳酸菌大量生長的培養基是制備濃縮型凍干發酵劑的前提，乳酸菌發酵劑的理論活菌數要求在109～1010CFU/mL，乳酸菌在MRS液體培養基上的活菌濃度并未達到理想水平，所以還必須在基礎培養基上進行營養強化，以便獲取較高的菌體生物量［9］。

針對乳酸菌生長的營養需求，在基礎培養基配方上添加不同的增殖因子，將MRS液體培養基活化過的植物乳桿菌按3%接種于添加增殖因子的培養基中，培養24 h后測定活菌數。初步篩選出番茄汁(8%)、胡蘿卜汁(8%)、香菇汁(8%)、玉米汁(8%)、CaCO3(0.5%)、卵磷脂(1%)、大豆低聚糖(1%)、甘露糖(1%)等進行單因素實驗，選擇增菌效果較為顯著的增殖因子進行下一步實驗。

1.2.3 植物乳桿菌增殖因子的正交試驗

在MRS液體培養基中添加初步篩選出的對植物乳桿菌增殖作用明顯的增殖因子，采用L9(34)正交試驗設計配制培養基，通過分析正交試驗結果，確定各成分的最佳濃度，獲得優化增菌培養基配方。菌株經過活化后，以3%接種量分別接種于上述增菌培養基中，35℃恒溫培養24 h，檢測培養后的活菌數。

1.2.4 菌體細胞濃縮分離條件的選擇

參照山麗杰［10］的方法，計算離心損失率、存活率和收得率，每組實驗做3個平行，統計分析并檢驗處理組之間差異顯著性，從而選擇最佳的離心參數。

由(1)、(2)、(3)式得出：

離心收得率/%=離心存活率/% ×(1-離心損失率/%)

1.2.5 菌體懸浮液濃度及凍干厚度的選擇

參照鄧鵬超［11］方法選擇最佳濃度的懸浮基質以及最佳凍干厚度。

1.2.6 凍干時間和含水量的關系研究

在無菌操作條件下，將凍干菌粉轉移到無菌恒重的小培養皿中，精確稱重，然后將樣品置于105℃烘干至恒重，計算凍干菌粉的含水量:

1.2.7 凍干保護劑及其復合配方的優化篩選

將植物乳桿菌活化2次，以3%接種量接入增殖培養基中，35℃培養24 h，離心收集菌體，將菌體懸浮于等體積的10%脫脂乳中，混勻，計數。將不同保護劑配成一定濃度的溶液，分別取1 mL脫脂乳的菌懸液和1 mL凍干保護劑到凍干瓶中(厚度為0.5 cm)，真空冷凍干燥，凍干后加入1 mL無菌水復溶，稀釋涂布，計算活菌數，分別選取海藻糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、明膠、L-谷氨酸鈉、半胱氨酸、抗壞血酸、甘油、山梨醇、蛋白胨等保護劑進行單因素多水平實驗［14］，篩選出凍干保護效果好的單個保護劑，進一步研究保護劑的復配效果。

保護劑的復配試驗:先配制10%脫脂乳，每10 mL體積分裝試管，分別將初篩出的4種保護劑加入脫脂乳中，配制成不同濃度組合的復合保護劑，混勻，等量溶解離心后的菌體，充分混勻，按2 mL(凍干厚度0.5 cm)的量加入凍干瓶中，進行真空冷凍干燥。

1.2.8 植物乳桿菌凍干存活率的計算

按照熊澤［6］的方法對凍干菌粉復水處理，再參照韓德權［15］方法計算凍干存活率:

式中:C1為凍干前1 mL菌液的活菌數，CFU/mL;C2為凍干后1 mL復水菌液的活菌數，CFU/mL。

1.2.9 濃縮型凍干菌粉成品特性研究

將增殖培養液4 000 r/min離心10 min收獲菌體，用生理鹽水洗滌，重復2次，加入原菌液體積1/10的復合保護劑(濃縮倍數按實際需要而定)，混合均勻，以2 mL分裝凍干瓶中，預凍，真空冷凍干燥36 h，得濃縮型凍干菌粉，4℃保藏。精確稱取1.000 0 g凍干菌粉，溶于10 mL無菌生理鹽水中，取1 mL稀釋平板計數，從而換算出1 g凍干菌粉的含菌量。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌增殖因子的單因素試驗

根據植物乳桿菌的營養需要，在MRS液體培養基的基礎上，添加各增殖因子后，35℃培養24 h，測定菌液的活菌數，單因素試驗結果見圖1。

圖1 不同生長因子對菌體增殖的影響Fig.1 Effect of different growth factors on the cell growth

由圖1可以看出，在基礎培養基中添加生長因子能提高植物乳桿菌活菌數(CaCO3除外)。由LSD均值多重比較分析可得，添加CaCO3的實驗組活菌數與CK組相比無顯著性差異(P＞0.05)。但有報道認為菌體在富鈣培養基中能夠增強其抗凍性［16-17］，因此選擇CaCO3作為增菌鹽類，其余實驗組與CK組相比活菌數增加顯著(P＜0.05)。添加胡蘿卜汁和香菇汁的實驗組增菌效果顯著大于(P＜0.05)其他實驗組，這是由于香菇汁中含有大量的真菌多糖及豐富的維生素，胡蘿卜汁中含有大量的維生素、胡蘿卜素和礦物質離子，能很好地滿足植物乳桿菌的生長。但添加胡蘿卜汁和香菇汁的兩組處理組之間差異不顯著(P＞0.05)，考慮到香菇汁成本相對較高，所以選擇胡蘿卜汁為增菌因子。其次，番茄汁實驗組增菌效果和卵磷脂、大豆低聚糖、甘露糖實驗組均無顯著性差異(P＞0.05)，考慮材料價格和來源故選擇番茄汁。綜合考慮最終選擇胡蘿卜汁、番茄汁和CaCO3進行下一步實驗。

2.2 乳酸菌增殖因子的正交試驗

通過上述的單因素試驗，選用胡蘿卜汁、番茄汁和CaCO3為試驗因素，設計L9(34)正交試驗，以獲得培養基最佳配方，其因素及水平如表1所示。

表1 增菌培養基各物質的正交因素水平表L9(34)Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

按照表1設計的增菌因子的正交因素水平表進行L9(34)正交分析實驗，吸取0.2 mL活化后的菌液涂布在添加增殖因子的培養基中，35℃培養48 h，計數，試驗重復3次，取平均數，結果如表2。方差分析結果見表3。

表2 增菌培養基的L9(34)正交分析實驗結果Table 2 Results of L9(34)orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Test of analysis of variance

從表2看出，以活菌數為直觀分析指標，通過比較R值，各因素對目標值影響順序為A＞C＞B。表3顯示，A因素水平的不同對活菌數有顯著性影響(P＜0.05)，B和C因素水平的不同對活菌數無顯著性影響(P＞0.05)。因此，從表2中選擇平均數大的最佳水平 A2、B2、C3組合成最優組合 A2B2C3，與實驗組最佳吻合，即胡蘿卜汁(8%)、番茄汁(8%)和CaCO3(0.75%)，活菌數為2.68×109CFU/mL。

2.3 菌體細胞濃縮分離條件的選擇

為了得到較高的含菌量，通過離心濃縮使菌體與代謝產物分開，形成適于冷凍干燥的懸浮液，從而提高冷凍干燥存活率。在離心分離過程中［18］，一方面，離心力機械作用以及溫度和基質pH值等因素的影響，會造成部分菌體死亡;另一方面，部分菌體必然殘留在上清液中造成損失。若離心工藝掌握不當，將直接導致發酵劑的活菌含量下降。為此，本實驗研究離心力、離心時間對菌體存活率的影響，其結果如表4。

表4 不同離心條件對植物乳桿菌離心收得率的影響Table 4 Effect of different centrifugal conditions on harvesting rate of L.plantarum

表4結果表明，隨著轉數的增加和時間的延長，離心損失率總體呈現減小的趨勢，離心損失率最大的是3 000 r/min離心5 min，損失率最小的是6 000 r/min，15 min。這表明離心力越小、離心時間越短，損失率越高;增大離心力和延長離心時間，均可顯著降低損失率。由離心存活率可見，6 000 r/min，15 min離心存活率最低，離心存活率最高的是4 000 r/min，10 min。離心收得率是衡量離心效果的最終體現，它與離心存活率成正比，而與離心損失率成反比。從經濟角度出發，盡量選取較小離心力和較短離心時間，離心收得率最高的是4 000r/min，10 min。

2.4 菌體懸浮基質和凍干厚度的選擇

脫脂乳屬于大分子蛋白質類，方便易得，是廣泛使用的菌體懸浮基質，對菌體起到凍干保護作用。凍干發酵劑物料層厚度(即凍干厚度)也會影響凍干時間和凍干效果［19］。將增殖培養后的菌液按最佳離心參數離心收集菌體，添加等量的不同濃度(8%、10%、12%、14%)的脫脂乳作為菌體懸浮基質且分裝成不同厚度的凍干瓶，真空冷凍干燥后，測其凍干存活率，選擇最佳懸浮基質的濃度和凍干厚度，每組實驗做3個平行，取平均值，結果如表5所示。

表5 脫脂乳的不同濃度和凍干厚度對菌體凍干存活率的影響Table 5 Effect on livability of cell by different consistency and thickness of skim milk after freezing-drying

從表5可知，添加脫脂乳基礎保護劑與無菌水的對照組相比，脫脂乳濃度的不同對菌體凍干存活率有極顯著性影響(P＜0.01)，凍干厚度的不同對菌體凍干存活率無顯著性影響(P＞0.05)，不加脫脂乳的無菌水對照組的菌體存活率僅為20%以內，絕大多數菌體在凍干過程中死亡，而添加脫脂乳保護劑的凍干存活率最低為36.728%，最高達到56.173%，保護效果明顯，通過LSD均值多重比較分析可得，脫脂乳濃度為8%、10%、12%、14%的實驗組凍干存活率與對照組均有極顯著性差異(P＜0.01)，脫脂乳濃度為10%的實驗組凍干存活率與8%和12%的實驗組有顯著性差異(P＜0.05)，而脫脂乳濃度為12%和14%的實驗組凍干存活率之間差異不顯著(P＞0.05)，綜合分析得出，保護效果最好的脫脂乳濃度為10%，其次為12%的濃度，最差為14%的濃度，分析原因可能是14%的脫脂乳濃度較大，固形物較多，溶液相對較黏稠，凍干過程中不利于水分的揮發，導致較多冰晶的形成，從而增大菌體的死亡率。從凍干厚度來看，10%和12%脫脂乳濃度的不同凍干厚度中，均為0.5 cm的厚度凍干存活率最高，而且通過直觀觀察，相同的凍干時間，凍干厚度為0.25 cm的凍干菌粉空隙較大，結構疏松，黏壁嚴重，凍干厚度為0.75 cm的凍干菌粉較為濕潤，凍干不完全。所以初步選擇0.5 cm進行下一步凍干時間的研究。

2.5 凍干時間和含水量的關系研究

凍干時間和含水量的關系見表6。

表6 不同凍干階段的菌粉含水量Table 6 The moisture content of powder of different stages of freeze-dried

利用真空冷凍干燥技術生產活菌制劑有利于菌種的保藏。研究表明，凍干發酵劑的含水量為1.5%～3.0%為宜［20］。如果含水量＞3.0%，發酵劑貯藏穩定性降低;而含水量＜1.5%，細胞的凍干死亡率提高［21］。因此，保證凍干發酵劑的含水量，必須嚴格掌握真空干燥時間。如表6所示，菌粉凍干前32 h含水量顯著性降低(P＜0.05)，凍干處理36 h后，含水量降到3%以下，隨后下降趨勢變緩，所以在本實驗室凍干設備條件下，凍干處理時間選定為36 h左右。

2.6 凍干保護劑及其復合配方的優化篩選

冷凍和干燥兩個過程會造成部分微生物細胞的損傷、死亡及某些酶蛋白分子的鈍化［22］。凍干保護劑是影響凍干發酵劑活力最重要的外部因素，也是采用凍干法制備高效濃縮發酵劑研究的技術關鍵。選擇海藻糖、蔗糖、麥芽糊精、明膠、谷氨酸鈉、抗壞血酸、甘油、山梨醇等食品級生化材料作為單因子保護劑，采用質量分數為10%脫脂乳為懸浮基質進行單因素實驗，每組做3個平行，取平均值，結果如表7所示。

由表7中凍干后活菌數的相關數據進行方差分析得，各種保護劑對凍干后活菌數應有顯著性差別，糖類物質對菌體凍干保護效果最佳，其中10%海藻糖實驗組凍干后活菌數顯著高于(P＜0.05)其他實驗組，存活率達66.67%，從動力學角度看，海藻糖能有效促進非晶形或玻璃狀固體形成［23］，從而減少冰晶的形成，起到防止細胞損傷的作用，海藻糖通過氫鍵與脂質雙分子層的脂類或蛋白質表面的水分子相連，降低了脂類由液晶向凝膠相轉移的溫度，從而起到保護作用，其次為麥芽糖，存活率為63.17%，谷氨酸鈉處理組的存活率也較高為61.32%，而半胱氨酸、甘油以及抗壞血酸實驗組與CK組之間無顯著性差異(P＞0.05)，對菌體的凍干保護效果不佳。

表7 凍干保護劑的單因素實驗結果Table 7 Results of different cryoprotectant factors

不同的保護劑對不同菌種的保護效果不同，單一的保護劑并不能滿足冷凍干燥的要求，所以抗凍保護劑一般都是按一定配方混合使用。復配保護劑中的各種成分在冷凍干燥中均發揮著各自的作用，相互間又具有協同效應，同時微生物細胞結構和大小存在差異性，只有復配保護劑中各保護劑的比例及濃度達到協調時，才能達到最佳的保護效果。在上述單因素保護劑的研究基礎上選用海藻糖(A)、麥芽糖(B)、谷氨酸鈉(C)進行優化，設計L9(34)正交試驗，其因素及水平如表8。以10%脫脂乳作為菌體懸浮基質，在這基礎上添加各種濃度的保護劑，測定凍干前后的活菌數，每組實驗做3個平行，計算菌體凍干存活率，結果見表9。方差分析結果見表10。

表8 復合凍干保護劑的正交因素水平Table 8 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

表9 復合凍干保護劑正交分析實驗結果(L934)Table 9 Results of L9(34)orthogonal experiment in cryoprotectant

表10 方差分析表Table 10 Test of analysis of variance

從表9的實驗數據和分析結果可以看出，以凍干后菌體存活率為測試指標，通過比較R值大小，各因素對目標值影響大小順序為A＞B＞C。表10方差分析結果表明，A和B因素水平的不同，其凍干存活率差異顯著(P＜0.05)，因此選擇平均數大的最佳水平A2和B2。但C(谷氨酸鈉)因素水平不同，其凍干存活率差異不顯著(P＞0.05)，綜合考慮節約成本，C(谷氨酸鈉)選擇濃度最低的水平即8%。則最優組合為A2B2C1，該組合在試驗方案中不存在，因此，將最優水平A2B2C1與試驗方案中凍干存活率最高的第6號試驗的水平組合A2B3C1進行驗證試驗，結果見表11。

表11 兩種組合保護劑對冷凍干燥的保護效果Table 11 The protective effects of two combinations of protective agent for freeze-drying

由表11可以看出，A2B3C1組合的保護劑用于植物乳桿菌冷凍干燥，活菌數為3.71×109CFU/mL，菌體存活率達到75.43%，綜合得到保護劑的最佳組合為:海藻糖(10%)、麥芽糖(12%)、谷氨酸鈉(8%)。

2.7 濃縮型凍干菌粉成品特性研究

對最終凍干菌粉成品進行分析，1 mL復水菌液的活菌數為5.93×1010CFU/mL，則10 mL菌液的活菌數為5.93×1011CFU/mL，因為1 g凍干粉溶解于10 mL無菌水中，即凍干菌粉成品濃度為5.93×1011CFU/g。

3 結論

本實驗以植物乳桿菌為發酵菌株，優化出植物乳桿菌增殖培養基的組成為:在MRS液體培養基的基礎上添加8%胡蘿卜汁、8%番茄汁、0.75%CaCO3，在此增殖培養基上活菌數能達2.68×109CFU/mL以上。采用離心法收集菌體，研究離心條件對菌體收得率的影響，主要考慮離心力和離心時間這2個因素，對離心前菌懸液、離心后上清液以及離心后菌體進行菌落計數，最終得出菌體最佳收集條件為4 000 r/min離心10 min。選用脫脂乳做為菌體懸浮基質可有效提高凍干存活率，研究脫脂乳濃度以及凍干厚度2個因素對凍干存活率的影響，結果表明，脫脂乳最佳濃度為10%，最佳凍干厚度為0.5 cm，且菌體凍干36 h后，其水分含量可滿足儲藏要求。本實驗通過單因子篩選和正交實驗優化，最終得到復合凍干保護劑為:海藻糖(10%)、麥芽糖(12%)、谷氨酸鈉(8%)，活菌數為3.71×109CFU/mL，凍干存活率可達75.43%。濃縮10倍凍干成品濃度為5.93×1011CFU/g。本研究探索了發酵肉制品凍干發酵劑的制備條件，提高了菌體凍干存活率，為凍干肉品發酵劑在我國的推廣應用提供了理論基礎。

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