植物源α-低聚半乳糖制備工藝條件優化*

侯曉慧，張金澤，林靜，段素芳，高加濤，周志橋

(中國食品發酵工業研究院，北京，100015)

低聚半乳糖(galactooligosaccharide，GOS)被認為是和母乳低聚糖結構最相近的低聚糖，已批準應用于嬰幼兒配方食品之中［1］。低聚半乳糖根據其糖苷鍵結構的不同，可分為 α-型和 β-型的低聚半乳糖［2］，目前工業生產的低聚半乳糖，以乳糖為原料，通過半乳糖苷酶的作用，得到β-型的低聚半乳糖［3-4］，其過程是乳糖水解產生的半乳糖基，連接到另一個乳糖的半乳糖基上，形成葡萄糖-半乳糖-半乳糖的所謂半乳三糖。半乳糖基再連接到半乳三糖上，形成半乳四糖，結構為:葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖，并可進一步形成半乳五糖、半乳六糖等等，也可生成半乳糖-半乳糖，半乳糖-半乳糖-半乳糖等低聚糖混合物。

澤蘭中含有棉子糖(果糖-葡萄糖-半乳糖)、水蘇糖(果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖)、毛蕊五糖(果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖)等 α-型的低聚糖［5］。使用微生物發酵的方法，可以定向把澤蘭低聚糖中的果糖剪切下來并加以利用，得到新型的α-型低聚半乳糖，其糖基的組成和用乳糖為原料生產的低聚糖一致，包括蜜二糖(葡萄糖-半乳糖)、半乳三糖(葡萄糖-半乳糖-半乳糖)、半乳四糖(葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖)、半乳五糖(葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖)等。本實驗在已篩選出符合實驗條件的菌株和進行了前期單因素試驗的基礎上，采用響應面法對其發酵條件做進一步優化，以期得到更高含量的α-低聚半乳糖產品。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

酵母菌(yeast，編號 SB)，北京君悅誠品科貿有限公司;酵母膏，北京奧博星生物技術有限公司;Mg-SO4(化學純)，北京五七六零一化工廠;KH2PO4(分析純)，西隴化工股份有限公司;MRS培養基(CM188)北京陸橋技術有限責任公司;營養肉湯培養基(CM142)，北京陸橋技術有限責任公司。

初始發酵培養基:酵母膏1.5 g/100 mL，MgSO4·7H2O 0.05 g/100 mL，KH2PO40.1 g/100 mL，溶于澤蘭浸提液，pH=(6.5±0.2)。

1.1.2 設備儀器

立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-75G)，上海東亞壓力容器制造有限公司;厭氧培養箱(XL-YY)，上海馨朗電子科技有限公司;智能恒溫恒濕培養箱(FJX-158S)，寧波海曙賽福實驗儀器廠;高效液相色譜儀、示差檢測器(LC10-AT)，日本島津公司;色譜柱(氨基鍵合柱 Hypersil-NH2，填料粒徑 5 μm，柱子尺寸 Φ 4.6 mm×250 mm)，大連依利特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵條件的優化設計

1.2.1.1 Plackett-Burman設計

通過單因素試驗發現，影響α-低聚半乳糖含量的主要因素有:發酵溫度、菌種接種量、初始糖濃度、酵母膏、MgSO4·7H2O和 KH2PO46個因素。用Plackett-Burman設計對以上6個因素進行全面考察，選用N=12的 P-B設計，G～L為虛擬變量，用來估計實驗誤差。各因素試驗設計水平見表1，實驗結果用Design-Expert軟件進行數據分析。

表1 Plackett-Burman試驗設計水平Table 1 Experimental levels of Plackett-Burman

1.2.1.2 最陡爬坡試驗接近最大響應區域

（1）進一步完善制度建設，加強制度落實。在全面貫徹執行國家有關規定及建設單位管理制度的基礎上，根據項目特點，針對性地補充完善各項管理制度（如：《航道疏浚施工控制要點》），作為企業內部的執行標準。并通過舉辦培訓班、班前教育等活動，使參建人員熟悉各項相應的管理制度。制定各項責任制（如：《技術、安全交底責任制》），明確崗位職責，加大考評、檢查及獎懲力度，使大家知道該干什么、怎么干等。

根據P-B設計結果篩選出影響α-低聚半乳糖含量的顯著因素，并以各顯著因素的正負效應確定下一步試驗的最陡爬坡路徑(包括變化方向和變化步長)，快速地逼近最佳區域。試驗設計見表2。

表2 最陡爬坡試驗設計Table 2 Experimental design of steepest ascent

1.2.1.3 響應面試驗設計

通過Plackett-Burman試驗確定出影響α-低聚半乳糖含量的主要因素，進而由最陡爬坡試驗確定接近響應值區域顯著因素的濃度，利用Box-Behnke試驗設計進一步優化。其試驗設計見表3。每個因素有3個水平，以α-低聚半乳糖含量為響應值，實驗數據用Design-Expert軟件進行多項式回歸分析。

表3 Box-Behnke試驗設計Table 3 Experimental levels of Box-Behnke

1.2.2 發酵條件

澤蘭經3遍80℃左右熱水浸泡榨汁得到浸提液，添加菌種及各種營養成分，放入恒溫搖床培養箱中培養一定時間后取樣測定。

1.2.3 α-低聚半乳糖含量的測定

發酵結束后，取50 mL糖液，加0.5 g活性炭對糖液進行脫色，加熱至80℃攪拌30 min左右，過濾，濾液稀釋至折光1.0，經0.22 μm微孔濾膜過濾到樣品中，用HPLC分析測定。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman設計篩選影響α-低聚半乳糖含量的主要因素

試驗設計及結果見表4。因素G-K為dummy variables。每組試驗有3個重復，以平均值為準。

各因素參數效應分析見表5，由表5可知，對α-低聚半乳糖含量有顯著影響(可信度＞90%)的發酵條件因素包括發酵溫度、初始糖濃度、酵母膏和KH2PO44個，且均為顯著負效應。由此，接下來的試驗主要考察這4個因素，且應適當降低各因素水平。

表4 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 4 Experimental design and results of Plackett-Burman

表5 Plackett-Burman試驗結果各參數分析Table 5 Parameter analysis and estimates of Plackett-Burman

2.2 最陡爬坡試驗接近最大響應面區域

根據Plackett-Burman試驗結果，及初始糖濃度、發酵溫度、酵母膏和KH2PO44個因素效應大小的比例，設定它們的變化方向和步長，其他因素分別取各自的低水平進行試驗，試驗設計及結果見表6。由表6可知，隨著4個重要因素的不同變化，糖液中α-低聚半乳糖含量的變化趨勢是先上升后下降，其中第4組的α-低聚半乳糖含量最高，響應變量接近最大響應區域，所以以第4組條件為中心點進行響應面分析。

表6 最陡爬坡試驗設計及結果Table 6 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 Box-Behnke試驗設計重要因素的最優水平

以發酵溫度、初始糖濃度、酵母膏和KH2PO44個重要因素為自變量，試驗設計及結果見表7。

以α-GOS(Y)含量為響應值，利用Design-Expert軟件對表7的結果進行回歸擬合，得到二階回歸方程為:Y=94.52+(1.410 17E-015)A-0.575B-(1.281 98E-015)C+0.025D-0.125AB-0.075AC+0AD+0.275BC+0.325BD+0.15CD-3.26A2-2.397 5B2-1.36C2-1.122 5D2。此數學模型的方差分析結果如表8所示，相關系數達到0.98，說明模型對實際情況的擬合較好。因此可用回歸方程對最佳發酵條件進行預測。

表7 Box-Behnke試驗設計及結果Table 7 Experimental design and results of Box-Behnke

表8 回歸模型方程的方差分析Table 8 Analysis of variance(ANOVA)of regression model of quadratic response

2.4 響應面分析及最佳發酵條件確定

利用Design-Expert軟件對回歸模型進行響應面分析，得到各響應面立體分析模型及等高線圖，見圖1～圖8。

圖1 Y=f(A，B)的響應曲面Fig.1 Response surface of Y=f(A，B)

圖2 Y=f(A，C)的響應曲面Fig.2 Response surface of Y=f(A，C)

圖3 Y=f(A，D)的響應曲面Fig.3 Response surface of Y=f(A，D)

圖4 Y=f(B，C)的響應曲面Fig.4 Response surface of Y=f(B，C)

圖5 Y=f(B，D)的響應曲面Fig.5 Response surface of Y=f(B，D)

圖6 Y=f(C，D)的響應曲面Fig.6 Response surface of Y=f(C，D)

由圖1～圖3可以看出，在較低發酵溫度時(＜28℃)α-低聚半乳糖含量有隨發酵溫度增高而增加的趨勢，在較高發酵溫度時(＞28℃)α-低聚半乳糖含量有隨發酵溫度增高而減少的趨勢;在發酵溫度不變的條件下，α-低聚半乳糖含量隨初始糖濃度、酵母膏或KH2PO4濃度的增大呈先增加后減少的變化趨勢，且在中心點附近的低濃度和高濃度的變化程度相接近。由圖4～圖5可以看出，在較低初始糖濃度時(＜9°Brix)α-低聚半乳糖含量有隨初始糖濃度增大而增加的趨勢，在較高初始糖濃度時(＞9°Brix)α-低聚半乳糖含量有隨初始糖濃度增大而減少的趨勢，且后者的變化程度明顯顯著于前者;在初始糖濃度不變的條件下，α-低聚半乳糖含量隨酵母膏或KH2PO4濃度的增大呈先增加后減少的變化趨勢。由圖6可以看出，在較低酵母膏濃度時(＜1.2 g/100 mL)，α-低聚半乳糖含量有隨酵母膏濃度的增大而增加的趨勢，在較高酵母膏濃度時(＞1.2 g/100 mL)，α-低聚半乳糖含量有隨酵母膏濃度的增大而減少的趨勢，但是變化程度不明顯;在酵母膏濃度不變的條件下，α-低聚半乳糖含量隨KH2PO4濃度的增大呈先增加后減少的變化趨勢，但是變化趨勢也不是非常明顯。

綜合圖1～圖6分析結果，發酵溫度、初始糖濃度、酵母膏和KH2PO4均對發酵液中α-低聚半乳糖含量有顯著影響，其中發酵溫度和初始糖濃度的作用更加顯著。四者之間存在交互影響作用，與方差分析結果一致。

通過響應優化器分析知α-低聚半乳糖含量的最大值出現在A、B、C、D 的編碼值分別為(0，-0.12，-0.01，-0.01)時，即發酵溫度為28℃、初始糖濃度為8.76°Brix、酵母膏濃度為 1.2 g/100 mL、KH2PO4濃度為0.21 g/100 mL時，此時α-低聚半乳糖含量達到最大值為94.55%。以此條件進行微生物發酵，三次發酵進行試驗驗證，得到 α-低聚半乳糖含量為94.0%，這與預測值基本吻合。經HPLC分析測定的結果見圖7。

圖7 α-低聚半乳糖圖譜Fig.7 The fingerprint of α-GOS

3 結論

本實驗通過Plackett-Burman設計及響應面分析，確定了微生物發酵的最佳條件為發酵溫度28℃、初始糖濃度8.76°Brix、酵母膏濃度1.2 g/100 mL、KH2PO4濃度0.21 g/100 mL。綜合以上工藝參數對澤蘭浸提液進行微生物發酵試驗得到的發酵液中α-低聚半乳糖含量為93.7%，比優化前含量提高了近8%。

［1］ 孫建琴，王惠群.母乳低聚糖及益生元與嬰幼兒營養和健康［J］.國外醫學兒科學分冊，2003，30(2):68-70.

［2］ 徐晨，陳歷俊，石維忱，等.低聚半乳糖的研究進展及應用［J］.中國食品添加劑，2011(1):205-209.

［3］ 薛雅鶯，袁衛濤，楊海軍.低聚半乳糖的特性及應用前景［J］.發酵科技通訊，2011，40(3):50-52.

［4］ Duarte P M Torres，Maria do Pilar F Goncalves，Jose A Teixeira， etal. Galacto-oligosaccharides:production，properties，applications， and significance as prebiotics［J］.Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2010，9(5):438-454.

［5］ Xingbin Yang，Yan Zhao，Nianwu He，et al.Isolation，characterization，and immunological effects of α—galacto—oligosaccharides from a new source，the herb lycopus iucidus turcz［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58(14):8 253-8 258.