高效液相色譜柱后衍生法測定雞肉中的18種氨基酸

金明，牛宏亮，袁輝，趙煜

(甘肅省輕工研究院，甘肅蘭州，730000)

雞肉中富含蛋白質，而蛋白質的質量主要取決于氨基酸的組成和比例，尤其是必需氨基酸的組成和比例［1］。在目前儀器分析的領域中，禽肉類產品中多種氨基酸的分析方法的相關報道較少。最常用的分析方法有:氨基酸專用分析儀分析，高效液相色譜聯合柱前衍生系統分析，高效液相色譜柱后衍生法分析等。但是氨基酸專用分析儀的價格昂貴，專屬性強，儀器利用率低;高效液相色譜柱前衍生法分析自動化程度低、對柱子的損害大、前處理繁瑣;而高效液相色譜柱后衍生法分析彌補了這些缺點——自動化程度高、衍生物的穩定性高、對柱子的損害小、前處理簡單［2］，尤其在一些中小型實驗室，能夠實現液相色譜檢測方法和液相色譜柱后衍生法之間的及時切換，提高了儀器的使用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美國七彩山雞肉，甘肅敦煌酒業有限公司提供。

18種氨基酸標準品:天門冬氨酸99.4%、蘇氨酸99.1%、絲氨酸 99.6%、谷氨酸 98.9%、甘氨酸98.8%、丙氨酸99.4%、纈氨酸99.4%、半胱氨酸99.1%、蛋氨酸99.2%、異亮氨酸99.4%、亮氨酸99.5%、酪氨酸99.4%、苯丙氨酸99.9%、脯氨酸99.0%、組氨酸99.5%、色氨酸99.1%、鹽酸賴氨酸99.2%、精氨酸99.0%，北京恒元啟天化工技術研究院;TRIONE?茚三酮柱后衍生試劑(型號T100C、色譜純)、酸性洗脫液Li275、中性洗脫液Li750、色譜柱再生液RG003等試劑，美國Pickering公司;石油醚(分析純)天津科密歐化學試劑有限公司;HCl(優級純)，北京化工廠。

1.2 儀器與設備

Agilent1200高效液相色譜分析儀(配有四元泵、紫外檢測器和真空在線脫氣機)，美國安捷倫科技有限公司;Pickering PCX柱后衍生儀(配有Pickering離子交換柱及Pickering PCX工作站)，美國Pickering公司;真空干燥箱(DZG-6050)，上海森信實驗儀器有限公司;電熱恒溫干燥箱;數控超聲波清洗器，上海科導有限公司;離心機，長沙湘儀儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 混合氨基酸標準溶液的配制

根據各個氨基酸在色譜圖上的響應值高低不同，為使它們的響應值在色譜圖上一致，配制混標時，將各個單標的濃度配制在40～160 μg/mL內［3］。

1.3.2 樣品處理

雞肉需要取不同部位絞碎、稱量2.0～5.0 g，采用石油醚索氏抽提4～6 h，除去樣品中的脂肪，烘干。將樣品轉入到帶塞的玻璃試管中加入6mol/L HCl，經抽真空充入氮氣封住試管口，110℃烘箱內恒溫水解24 h，取出放置冷卻，將水解液用濾紙過濾到50 mL的容量瓶中用去離子水定容，再吸取1～2 mL于10 mL容量瓶內，50℃真空干燥后用去離子水定容，過 0.45 μm 膜，上機檢測［4］。

1.3.3 色譜分析條件

離子交換柱:Lithium Ion-exchange Column，3.0 mm ×250 mm;保護住(Lithium Guard Column)，2.0 mm×2.mm，紫外檢測波長570 nm;反應器溫度，130℃;衍生試劑，茚三酮;衍生試劑流速0.30 mL/min;柱溫，40℃;進樣體積，10 μL。梯度洗脫條件:流動相流速0.32 mL/min，按表1中的條件進行梯度洗脫［5］

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase composition for the gradient elution program used in the chromatograph analysis

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

本試驗中選用的流動相為 Li275、Li750、RG003的梯度洗脫。Li275為酸性洗脫液，Li750為中性洗脫液，RG003為色譜柱再生液，全部由美國Pickering公司提供，使用該流動相時儀器響應信號較高。在這個流動相體系的梯度下洗脫，各個組分的分離比較好，得到滿意的色譜圖。

2.2 樣品前處理方法

由美國 Pickering公司提供的 SERAPREP和URIPREP 2種樣品前處理試劑對雞肉類樣品并不適用。通過實驗證明，還是傳統的將樣品經過索氏抽提去除脂肪后再用HCl水解的方法比較實際，雖然時間較長，但是樣品回收率比較高。

2.3 標準色譜圖和雞肉樣品色譜圖

圖1 18種氨基酸的標準色譜圖Fig.1 Chromatograms of 18 mixed standards amion acids

2.4 標準曲線和線性范圍

圖2 雞肉自身樣品中的18中氨基酸Fig.2 Chromatograms of 18 mixed amion acids in chicken sample

準確吸取已配制好的18種氨基酸的標準溶液2、4、8、10、20 μL 進樣，以峰面積對濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。其中以天冬氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸為例，其回歸方程分別和相關系數分別為:Y=5.26e+004x+1.37e+002，r=0.999 2;Y=5.35e+004x-1.47e+003，r=0.999 0;Y=3.93e+004x+2.51e+002，r=0.999 5。表明18種氨基酸在8 ～80 μg/mL內線性關系良好。其他氨基酸的回歸方程和相關系數見表2。

2.5 方法的精密度、重復性和回收試驗

精密度試驗:準確吸取18中氨基酸混標10μL進樣，在上述色譜條件下重復進樣6次，測定峰面積，其中以天冬氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸為例，計算其RSD分別為0.87%、0.81%、0.95%(n=6)。

重復性試驗:準確稱取5份樣品，按樣品處理方法處理制備樣品溶液，進樣測定，記錄峰面積，其中以天冬氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸為例，計算其RSD分別為 1.2%、0.9%、1.1%(n=5)。

取已經測得含量的樣品溶液，分別加入18種氨基酸混標溶液，0.5、1、2 mL，其中以天冬氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸為例，測得其平均回收率和相關系數分別為:102.5%(RSD=1.15%)、92.4%(RSD=1.04%)、87.6%(RSD=0.94%)。

其他氨基酸的精密度、重復性和回收試驗數據見表2。

表2 試驗方法線性、精密度、重復性、回收試驗數據表Table 2 linear，precision，repeatability，recovery of test method

2.6 七彩山雞不同部位雞肉中的氨基酸組成

按照上述1.3.2的樣品處理方法和1.3.3的色譜條件，對七彩山雞不同部位肉的18種氨基酸進行檢測，結果見表3。

表3 七彩山雞不同部位肉中18種氨基酸的含量Table 3 The content of 18 amino acid in different parts of chicken

從表3中得出:七彩山雞雞肉中18種氨基酸的平均含量為:天冬氨酸18.78 mg/g、蘇氨酸9.96 mg/g、絲氨酸 9.16 mg/g、谷氨酸 10.28 mg/g、甘氨酸12.31 mg/g、丙氨酸11.71 mg/g、纈氨酸10.18 mg/g、半胱氨酸 2.48 mg/g、蛋氨酸 5.72 mg/g、異亮氨酸8.49 mg/g、亮氨酸 11.22mg/g、酪氨酸 9.05 mg/g、苯丙氨酸9.44 mg/g脯氨酸9.66 mg/g、組氨酸3.15 mg/g、色氨酸 6.14 mg/g、鹽酸賴氨酸 8.97 mg/g、精氨酸10.91 mg/g，雞腿肉中各個氨基酸含量水平最高。整個雞肉中必需氨基酸(EAA)的含量為70.12 mg/g，氨基酸總量(TAA)為167.61 mg/g。非必需氨基酸(NEAA)含量為 97.49mg/g。EAA/TAA為41.84%，EAA/NEAA為0.72，分別超過WHO/FAO提出的EAA/TAA應為40%左右和EAA/NEAA應為0.6以上的參考蛋白質模式標準［6-8］。

2.7 七彩山雞肉中與普通市售雞肉樣品中18種氨基酸含量的比較

經過計算，普通雞肉中必需氨基酸(EAA)的含量為:57.96 mg/g，氨基酸總量(TAA)為:141.77 mg/g。非必需氨基酸(EAA)的含量為:83.81 mg/g。EAA/TAA為:40.88%，EAA/NEAA為0.69，分別超過WHO/FAO提出的EAA/TAA應為40%左右和EAA/NEAA應為0.6以上的參考蛋白質模式標準。但是都低于美國七彩山雞肉中EAA/TAA和EAA/NEAA 的比值［9-10］。

表4 七彩山雞肉和普通雞肉樣品中18種氨基酸含量對比數據表Table 4 The contrast data of 18 amino acid，content in colorful montain chicken and ordinayr chicken

3 結論

3.1 檢測方法可行性

采用石油醚索氏抽提去除脂肪，6 mol/L鹽酸水解樣品。并且優化了色譜條件，采用Lithium Ion-exchange色譜柱(3.0 mm×250 mm)，流動相采用Li175、Li750、RG003的梯度洗本文研究了高效液相色譜柱后衍生法測定雞肉中18種氨基酸的前處理方脫。以TRIONE茚三酮為柱后衍生試劑，檢測波長為570 nm。試驗方法的線性回歸、精密度、重復性、回收率等試驗都滿足檢測的要求。方法簡便、快捷、準確，分離效果好，選擇性高，檢測靈敏度高，方法穩定，同時適用于其他各種肉類產品中18種氨基酸的檢測。并且分析了雞肉中氨基酸的種類和比例，EAA/TAA為:41.84%，EAA/NEAA為0.72，分別超過 WHO/FAO提出的EAA/TAA應為40%左右和EAA/NEAA應為0.6以上的參考蛋白質模式標準。

3.2 雞肉樣品中18種氨基酸的含量

分別對美國七彩山雞肉和市售普通雞肉中的18種氨基酸進行測定，根據試驗數據，2種雞肉中EAA/TAA和EAA/NEAA的比值分別都超過WHO/FAO提出的EAA/TAA應為40%左右和EAA/NEAA應為0.6以上的參考蛋白質模式標準。但是二者比之，七彩山雞肉的EAA/TAA和EAA/NEAA的比值比普通市售雞肉更高。

［1］ 吳坤，孫秀發.營養與食品衛生學［M］.北京:人民衛生出版社，2005.

［2］ 呂瑩果，張暉，孟祥勇，等.氨基酸分析測定及衍生化方法［J］.糧食與油脂，2009(7):171-174.

［3］ 高燕紅，龍朝陽，魯琳.應用柱前衍生和柱后衍生法測定氨基酸方法的比較［J］.中國醫學檢驗雜志，2004，5(2):133-135.

［4］ 中國預防醫學科學院營養與食品衛生研究所.GB/T5009.124-2003食品中氨基酸的測定［S］.北京:中國標準出版社，2003.

［5］ 趙晶晶，李宏梁.茚三酮柱后衍生法測定軟香酥糕點中氨基酸含量及其營養評價［J］.食品科學，2011，32(9):295.

［6］ 鄭藝梅，李群，華平，等.發芽糙米蛋白質營養價值評價［J］. 食品科學，2006，27(10):549-551.

［7］ 李培兵，王永輝，等炳南，等.羊胎素中氨基酸測定與評價［J］. 氨基酸和生物資源，2009，31(3):20-22.

［8］ 王詠星，錢龍，呂燕，等.白斑狗魚肌肉氨基酸含量測定及其營養評價［J］. 食品科學，2010，31(11):238-240.

［9］ 葉紅，唐鑫生.烏梢蛇不同生長時期蛇蛻的氨基酸分析［J］. 中國中藥雜志，2007，32(11):1091.

［10］ 柳琪，騰葳，張炳春.中華鱉氨基酸和微量元素蛋白質中氨基酸的分析與研究［J］.氨基酸和生物資源，1995，17(1):18.