戊糖片球菌產蛋白酶對發酵鰱魚魚糜凝膠性能的影響*

戴夢婕，許艷順，姜啟興，夏文水

(江南大學食品學院，江蘇無錫，214112)

我國淡水魚資源豐富，發酵是一種重要的淡水魚加工手段。生物發酵可以改善淡水魚糜制品風味，賦予產品獨特的凝膠質構和口感，同時還增加了產品的營養價值，延長了保質期［1］。近年來，研究人員對發酵魚糜的工藝進行了系統研究，通過單一和混合發酵劑進行淡水魚糜發酵，得到了具有風味獨特、高凝膠強度的發酵魚糜制品［2-3］。凝膠性能是體現魚糜制品品質的重要指標，魚糜凝膠形成機理受到國內外的廣泛關注，目前對它的機理研究主要集中在微生物發酵產酸對凝膠形成的作用方面［4］。微生物在發酵過程中除了產酸還會產生大量的代謝產物，如微生物酶、胞外多糖等，微生物產酶對魚糜的影響不能忽視，但是有關微生物酶在魚糜凝膠形成中的作用的研究鮮見報道。

本文選取1株廣泛用于發酵魚糜工藝的菌種——戊糖片球菌作為產酶研究對象，利用葡萄糖酸內酯(GDL)和抗生素建立模擬發酵體系，探討戊糖片球菌產酶對魚肉蛋白及鰱魚肌動球蛋白的蛋白質降解作用以及其對魚糜凝膠性能的影響。

1 材料，設備和方法

1.1 材料與設備

1．1．1 主要材料

鰱魚:鮮活，體重2～3 kg/條，購于無錫雪浪農貿市場。

菌種:戊糖片球菌，由食品學院提供。

葡糖糖酸內酯(GDL)，含量≥99%，食品級。

1．1．2 主要試劑

青霉素，中諾藥業有限公司;鏈霉素，深圳華藥南方制藥有限公司;兩性霉素B，上海金穗生物科技有限公司;干酪素、(NH4)2SO4、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷(tris)等，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1．1．3 主要儀器和設備

TA-XT2i質構儀，英國Sable Micro Systems公司;S3500激光粒度分析儀，美國Microtrac公司;冷凍離心機，德國Sigma公司;UV-1000紫外-可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司;pH計，梅特勒-托利多儀器上海有限公司;西貝樂SQ2119DX多功能食品加工機，上海帥佳電子科技有限公司。

1.2 實驗方法

1．2．1 戊糖片球菌產酶及粗酶液提純

將經過2次活化的戊糖片球菌以4%的接種量接種到液體MRS培養基中33℃培養20 h后，10 000 g離心15 min(4℃)，上清液即為粗酶液。用不同的飽和度的(NH4)2SO4溶液鹽析粗酶液，置4℃冰箱中過夜，選擇60%最佳飽和度使蛋白質沉淀完全后，于10 000 g，4℃離心15 min，用Tris-HCl緩沖液(pH 6．8)按1∶5(V/V)溶解沉淀后透析［5］。采用紫外法測定酶活。

1．2．2 建立模擬酸化體系

將新鮮鰱魚(2～3 kg/條)去頭、清洗、取肉后，添加2．5g/100g 葡萄糖酸內酯(GDL)、抗生素［6］(20 mg/100 g青霉素，20 mg/100 g鏈霉素，20 mg/100 g兩性霉素)、2%葡糖糖、2%食鹽制成魚糜樣品。將魚糜樣品分成均等的2份，1份按照200 u/100 g魚糜添加粗酶液制成加酶組［7］，另1份每100 g魚糜添加與粗酶液等量體積的 Tris-HCl緩沖液(pH 6．8)作為空白對照。將2份樣品攪拌均勻后灌腸，置于30℃的培養箱中。

1．2．3 鰱魚肌動球蛋白的提取

提取方法參照 Riebroy等的方法［8］，將魚肉絞碎，加入5倍(w∶v)的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6．8)，內含有 0．05 mol/L NaCl，勻漿，5，000 g，4 ℃離心10 min棄去上清液，沉淀部分按上述步驟重復操作2次。將收集的沉淀懸浮于10倍(w∶v)的0．6 mol/L NaCl溶液(pH 7．0)中，勻漿，10 000 g，4 ℃離心10 min，用尼龍網過濾去除上清液的結締組織后加入3倍體積的冷蒸餾水是肌動球蛋白沉淀，10 000 g，4℃離心10 min收集沉淀，即為肌動球蛋白樣品。用0．6 mol/L NaCl溶液將肌動球蛋白溶解稀釋到10 mg/mL，用HCl溶液調節 pH 值分別為5．0和4．5。按1∶1體積比添加粗酶液，35℃反應24 h后進行濁度，粒徑，TCA-溶解肽等指標測定。

1．2．4 pH 及微生物分析

取10 g魚糜，加入90 mL生理鹽水均質后用pH計測定pH值。無菌取樣10 g，加入90 mL無菌生理鹽水，混合均勻后吸取1 mL上清液進行梯度稀釋，選擇適合梯度采用涂布平板法在PCA培養基上37℃培養48 h后計數。

1．2．5 非蛋白氮含量測定

非蛋白氮含量測定參考Dierick［9］等的方法。

1．2．6 TCA-溶解肽含量的測定

參照Visessanguan等［10］的方法，取3 g絞碎的魚糜樣品，加入27 mL 4℃的5%的TCA溶液，均質后于4℃靜置1 h后，在4℃下12，000 g離心15 min，以牛血清蛋白(BSA)繪制標準曲線，采用雙縮脲法測定上清液中蛋白質含量。TCA-溶解肽含量用μmol tyrosine/g表示。測定肌動球蛋白TCA-溶解肽的變化處理樣品時用10%TCA溶液與肌動球蛋白按體積比1∶1混合，其他步驟與測定魚糜樣品一致。

1．2．7 濁度分析

將肌動球蛋白稀釋到0．2 mg/mL，進行相應處理后測定在350 nm處的吸光度值。

1．2．8 粒徑分析

將肌動球蛋白稀釋到1 mg/mL，用激光粒度分析儀測定蛋白粒徑。

1．2．9 凝膠強度的測定

參照Benjakul等［11］的方法，用20 mm長的凝膠樣品(去除腸衣)放置在TA-XT2i質構儀試驗臺上，采用P50s球形探頭，以1．0 mm/s速度穿刺樣品至strain 50%處，穿刺曲線上的第1個峰即為破斷強度，對應的距離為凹陷深度。

凝膠強度(g·cm)=破斷強度(g)×凹陷深度(cm)

破斷強度反映凝膠硬度，凹陷深度反映魚糜凝膠彈性。每個樣品做3次平行測定。

1．2．10 數據處理

采用軟件Origin8．5和SPSS 18對試驗結果進行統計分析。

2 數據與分析

2.1 模擬酸化體系pH變化

從圖1中看出，空白組和加酶組在加入GDL和抗生素4 h后pH值從6．5左右降到4．5左右，并在之后的92 h內兩者無明顯差異，pH值在4．5上下略有浮動。根據其他學者研究發現，pH值的降低會引起蛋白質的變性，對魚糜凝膠強度產生影響［3］，保持pH值穩定性與一致性有利于在酸化體系中客觀評價微生物酶對蛋白質的作用以及凝膠性能的影響。

圖1 酸化體系pH變化Fig．1 The changes of pH in the acidified system

2.2 模擬酸化體系微生物分析

如圖2顯示，由于抗生素的作用以及GDL產生的低酸環境，酸化體系中的微生物的生長繁殖受到一定抑制，在96 h的反應過程中，增長趨勢平緩，菌落總數控制在104～105CFU/g，不添加抗生素的自然條件下魚糜微生物數量由初始值104～105CFU/g在24 h內快速增長至108CFU/g，并在之后72 h保持增長最終達到109～1010CFU/g，遠高于添加抗生素和GDL的模擬酸化體系中微生物數量。微生物發酵魚糜中的微生物生長情況與酸化體系相似，發酵菌種成為魚糜發酵過程中的優勢菌，抑制了其他雜菌的生長，除了發酵菌種本身外的其他菌數量也在104～105CFU/g。

圖2 酸化體系微生物變化Fig．2 Microbiological changes in the acidified system

2.3 酸化體系蛋白質降解分析

非蛋白氮的增加是由于魚肉蛋白在微生物蛋白酶和內源組織蛋白酶的作用下發生了降解作用，生成了低分子質量的多肽和游離氨基酸等。從圖3中發現，在反應過程中，空白組與加酶組的非蛋白氮含量在反應24 h時較為接近，分別為4．31和4．93 mgN/g，加入蛋白酶的樣品非蛋白氮增長迅速，在96 h時達到 9．73 mgN/g，此時空白組只有 8．47 mgN/g。添加的戊糖片球菌蛋白酶在酸化體系中與蛋白質作用，和內源酶共同生成了較多的低分子質量多肽和游離氨基酸。尤其在24h之后，加酶樣與空白樣差異性增大，產生的非蛋白氮含量明顯增多。

圖3 酸化體系NPN變化Fig．3 The changes of NPN in the acidified system

由圖4可知，酸化體系中TCA-溶解肽隨時間的延長逐漸上升，同時加酶組的含量在96 h中一直高于空白組，增加速度快，含量高，在96 h時加酶組含量多 達 156．2 μmol Tyr/g，比 空 白 組 高 出 27．7 μmol Tyr/g，與開始24 h相比，加酶組與空白組間差異明顯加大，這說明戊糖片球菌產酶對魚糜中蛋白質產生降解作用，魚糜中低分子肽和游離氨基酸含量增多［12］，隨著反應時間的增加，戊糖片球菌產酶對魚糜的作用更加顯著。

圖4 酸化體系TCA-溶解肽變化Fig．4 The changes of TCA-soluble peptides in the acidified system

2.4 鰱魚肌動球蛋白降解及聚集程度分析

圖5顯示了在2種不同pH下的鰱魚肌動球蛋白TCA-溶解肽的變化。在pH4．5的肌動球蛋白中，加入戊糖片球菌蛋白酶的樣品TCA-溶解肽含量明顯高于空白樣含量，pH 5．0的肌動球蛋白中加酶樣比空白樣的含量有增加，但增幅不明顯。這一方面是因為戊糖片球菌產的蛋白酶為酸性蛋白酶，其最適pH更接近4．5，對蛋白質降解程度大于pH 5．0的肌動球蛋白。

圖5 肌動球蛋白TCA-溶解肽變化Fig．5 The changes of TCA-soluble peptides in silver carp actomyosin

濁度和粒徑可以用于監測蛋白質的聚集動力學過程。2種pH下肌動球蛋白的濁度和粒徑的變化見表1。從表1中看出，pH 5．0條件下的濁度在加酶前和加酶反應后都低于pH 4．5條件下的濁度。濁度的增加表明肌動球蛋白分子相互作用形成了大分子聚集物，利用分光光度計檢測時導致光散射增加［13］。2種pH下加入蛋白酶反應后濁度降低，說明蛋白酶的作用破壞了肌動球蛋白的聚集狀態，由于蛋白質的聚集狀態直接影響凝膠的網絡結構，蛋白的聚集狀態被蛋白酶破壞后，對凝膠形成亦造成破壞作用。從粒徑角度分析，總體上粒徑隨著pH的降低而增大，同時蛋白酶的加入導致粒徑減小，pH4．5條件下由91．26 μm 減低到 85．30 μm。而 pH 5．0 條件下，加入酶反應24 h后粒徑減小3．74 μm ，pH 4．5 條件下減小幅度更為明顯。

表1 肌動球蛋白濁度及粒徑變化Table 1 The changes of turbidity and particle size in silver carp actomyosin

2.5 酸化體系凝膠強度測定

表2反映了蛋白酶加入模擬發酵體系后對魚糜蛋白的凝膠強度的影響。在體系形成4 h后，隨著模擬發酵體系的pH值下降并趨于穩定，因為GDL作用魚糜的凝膠強度較大。隨后在12 h及24 h中魚糜的破斷強度和凹陷深度的變化較小，魚糜的硬度和彈性保持穩定，添加蛋白酶的魚糜與空白組之間差距不明顯，甚至在12h時加酶組的凝膠強度略大于空白組。在24 h后空白組和加酶組的凝膠強度都開始明顯下降，但加酶組魚糜的彈性和硬度下降幅度更大，加酶組魚糜凝膠強度始終低于空白組，在96 h后空白組的凹陷深度減少0．11 cm，加酶組減少0．14 cm;空白組破斷強度減少299．1 g，加酶組減少354．9 g，其彈性和硬度明顯低于空白組。加酶組96 h時的凝膠強度僅為4 h時凝膠強度的32．9%。造成空白組和加酶組凝膠強度降低及兩者差異的原因可能是空白組魚糜中的內源組織蛋白酶對蛋白產生降解作用，而加酶組則由內源組織蛋白酶和微生物酶共同作用，在魚糜凝膠形成后對凝膠產生劣化影響。

3 結論

在穩定的低酸性環境中，戊糖片球菌產蛋白酶降解了魚糜中蛋白質，生成了低分子肽和游離氨基酸。蛋白酶一定程度上破壞了肌動球蛋白的聚集，并且在pH 4．5條件下蛋白酶對肌動球蛋白的影響更大。戊糖片球菌產蛋白酶對魚糜凝膠的硬度和彈性都產生劣化影響并且作用強度隨著反應時間的增加而增大，作用時間主要在凝膠形成24 h后。這些有關戊糖片球菌產酶對發酵魚糜的研究在進一步了解了發酵魚糜凝膠形成機理的同時將有助于今后發酵魚糜工藝的改進及發展。

表2 不同時間下空白組和加酶組的凝膠強度變化Table 2 The changes of gel strength in the acidified system

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