發酵面團中抗單增李斯特氏菌乳酸菌的篩選及鑒定*

李東霞，王雁萍，李宗偉，袁世超，楊慧曉，金慶生

1(鄭州大學離子束生物工程省重點實驗室，河南鄭州，450052)2(浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所，浙江杭州，310021)

單增李斯特氏菌是一種威脅人畜健康的重要病原菌;該菌在自然界分布廣泛，在土壤、污水、糞便、動物飼料中均有存在，且動物很容易攝入該菌，并且通過攝入和排泄的途徑到處傳播［1］。近年來，在某些食品如乳制品，肉制品以及即食用型蔬菜中該菌檢出率很高，因食品污染李斯特氏菌而引起的食物中毒，腦膜炎及敗血癥病例也頻繁發生。采取有效的措施控制單增李斯特氏菌在食品中的污染，消除其對食品安全及人類健康造成的威脅已經引起世界各國的重視［2-3］。

近年來，一些學者發現應用食品級乳酸菌產生的細菌素是抑制單增李斯特氏菌的一種有效方法［4］。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是發酵糖類主要產物為乳酸的革蘭氏染色陽性細菌，其具有拮抗腸道內病原菌的作用，可通過產生有機酸、過氧化氫和細菌素等多種代謝產物，抑制食品中的腐敗菌和病原菌;現已被廣泛應用于食品加工、醫藥保健、飼料發酵及畜禽疾病防治等方面。乳酸菌細菌素(Bacteriocins of LAB)是指乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成的對革蘭氏陽性菌有抑制作用的多肽或蛋白質類物質。由于食品病原菌和濫用抗生素危害的加劇，人們開始尋找天然安全的食品添加劑，細菌素以其無毒性、易被消化道內酶降解等特性，被公認為具有應用于食品和飼料中殺菌防腐的潛力［5-6］。

我國乳酸菌資源豐富，如何有效地開發利用現有的乳酸菌資源尤為重要。現在，一些學者開始重視研究來自傳統食品中的優良乳酸菌菌株［7］。發酵面食是我國傳統食品之一，我國傳統發酵面食采用的“面引子”由于其自然發酵產生的多種芳香物質能夠賦予面食特殊的風味，也是發酵面食所用菌種的主要來源。在不同地區的發酵面團中，真菌主要以酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)為主，細菌主要以乳酸菌(lactic acid bacteria)為主［8-9］;但是目前關于發酵面團來源的乳酸菌及其抑菌活性的研究較少。

本研究以普通發酵面團為乳酸菌分離源，并從中篩選到一株對單增李斯特氏菌有較強抑制作用的乳酸菌，經鑒定該菌為Lactobacillus curvatus，為其在食品和飼料中進一步深入研究和應用奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗菌株

乳酸菌菌株共54株，分離自河南開封，商丘，天津，黑龍江大興安嶺呼瑪縣四地區家庭普通發酵面團樣品，根據形態學特征初定為乳酸菌;指示菌為單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，ATCC BAA-751)，保存于本實驗室。

1.2 試劑及培養基

過氧化氫酶，胰蛋白酶，蛋白酶K，菌株DNA提取試劑盒，MRS培養基，NA培養基。

2 實驗方法

2.1 抗單增李斯特氏菌乳酸菌的初篩

將保存于-80℃冰箱中的54株乳酸菌活化后，接種到MRS液體培養基，30℃培養24 h。制備乳酸菌無細胞發酵上清液，制備指示菌菌懸液，采用牛津杯雙層平板法進行抑菌試驗［10］。

2.2 產抗單增李斯特氏菌細菌素乳酸菌的復篩

2．2．1 酸作用的排除

挑取對單增李斯特氏菌有抑制作用的菌株，制備無細胞發酵上清液，測上清液的pH值，用2 mol/L NaOH調發酵上清液pH值至7．0，用牛津杯雙層平板法做抑菌試驗。

2．2．2 過氧化氫酶作用的排除

將酸排出后依然有抑菌作用的乳酸菌菌株無細胞發酵上清液pH調至7．0，按照過氧化氫酶終濃度為1．0 mg/mL加入到發酵液中，37℃水浴2h，檢測其抑菌活性。

2．2．3 蛋白酶解檢測

挑取篩選出的乳酸菌制備無細胞發酵上清液，調發酵上清液pH至7．0，按100μg/mL加入胰蛋白酶和蛋白酶K，同上處理。

2.3 乳酸菌細菌素初步分析

2．3．1 熱敏感性

將篩選出的菌株無細胞發酵上清液pH調至7．0后分別置60℃，80℃，100℃水浴鍋30 min和60 min，121℃滅菌鍋15 min;冷卻后進行抑菌實驗。

2．3．2 pH 敏感性

用2 mol/L HCL和2 mol/L NaOH調無細胞發酵上清液 pH 值分別為 2．0、3．0、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0，37 ℃溫育2 h 后，進行抑菌試驗。

2．3．3 共培養性質

將乳酸菌上清液和單核增生李斯特菌進行試管混合共同培養，在NA液體培養基內按照5∶2的體積比例接入乳酸菌無細胞發酵上清液，再加入100μl培養24h的單增李斯特氏菌菌液;每4 h取樣，測定600 nm條件下的光密度值;以NA液體培養基接入MRS液體培養基，再加入同上單增李斯特氏菌菌液為對照。以共培養時間為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制乳酸菌上清液與單核增生李斯特菌共培養的曲線圖。

2．3．3 細菌素分子量的測定

乳酸菌菌株無細胞發酵上清液經70%飽和度硫酸銨鹽析、透析及超濾濃縮處理，將依然保留較強抑菌活性的純化液采用Tricine-SDS-PAGE［11］方法測定細菌素分子量。

2.4 產細菌素乳酸菌的鑒定

根據乳酸菌生理生化特性以及16S rDNA的遺傳學鑒定［12］。

3 結果

3.1 初篩結果

對實驗室保存的從發酵面團中分離出的54株乳酸菌進行抑菌試驗，發現有43株對單增李斯特氏菌有較強的抑制作用。挑選這43株菌進一步篩選產抗單增李斯特氏菌細菌素的乳酸菌。

3.2 復篩結果

43株乳酸菌中只有編號為ZZU M5-2的菌株在酸排除及過氧化氫排除后仍然有抑菌活性。如表1及圖1所示，在pH調至7．0后，菌株ZZU M5-2的上清液與原液相比抑菌作用有所減弱，但依然保留非常明顯的抑菌活性;由此推測其發酵上清液中存在除有機酸以外的其他抑菌活性物質。乳酸菌在生長代謝過程中可能產生過氧化氫抑制其他細菌的生長，因此實驗將ZZU M5-2菌株發酵上清液pH調至7．0后加過氧化氫酶處理，結果顯示其抑菌圈直徑較酸排除處理的差別不大，這說明該菌株發酵上清液主要抑菌活性物質不是過氧化氫。

表1 ZZU M5-2的抑菌效果Table 1 Antimicrobial activity of ZZU M5-2

將菌株ZZU M5-2的發酵上清液進行胰蛋白酶和蛋白酶K的酶解實驗，發現在加入胰蛋白酶或蛋白酶K后其抑菌活性完全消失，如圖1所示，說明菌株ZZU M5-2發酵上清液中存在的主要抑菌活性物質是蛋白類物質，是一類細菌素。

圖1 ZZU M5-2的抑菌效果Fig．1 Antimicrobial activity of ZZU M5-2

3.3 細菌素初步分析

3．3．1 細菌素對熱的穩定性

將pH值調至7．0的乳酸菌無細胞發酵上清液分別在60、80、100 ℃處理30和60 min，121 ℃15 min后做抑菌試驗，結果如表1所示，其在60和80℃熱處理后抑菌活性基本保持不變，表現出良好的熱穩定性，且加熱時間對其影響不大;但隨著溫度的繼續升高，加熱時間延長，其抑菌活性逐漸降低，甚至在121℃時完全消失。

3．3．2 細菌素對pH的穩定性

從表1可以看出，菌株M5-2產生的細菌素在pH 2．0～8．0范圍內，對單增李斯特氏菌有抑制作用;且其抑菌活性隨著pH值的減小而增大，當pH 9．0時，抑菌活性消失。這說明該菌株產生的細菌素在酸性及中性環境中可以很好地發揮抑菌作用。

3．3．3 共培養性質

由圖2可知，在培養8h之前加入ZZU M5-2發酵上清液與對照相同對單增李斯特氏菌的生長沒有明顯影響，在8h后可以看出2種處理的單增李斯特氏菌都進入了對數生長期，但是加入ZZU M5-2發酵上清液的處理與對照相比生長緩慢，且隨著時間的延長這種趨勢越來越明顯，并在24h時比對照提前進入穩定期;這進一步說明ZZU M5-2發酵上清液中抑菌物質可以明顯抑制單增李斯特氏菌的生長。

圖2 ZZU M5-2發酵上清液對單核細胞增生李斯特菌的抑制作用Fig．2 The inhibition of ZZU M5-2 towards L．monocytogenes

3．3．4 細菌素分子質量的測定

將分離純化的細菌素樣品經過Tricine-SDSPAGE電泳分析，所得電泳圖譜見圖3，ZZUM5-2產生的細菌素分子質量約為25 kDa。

圖3 ZZU M5-2產細菌素的電泳圖譜Fig．3 Tricine-SDS-PAGE of bacteriocin produced by ZZU M5-2

3.4 產細菌素乳酸菌的鑒定

3．4．1 菌落形態

菌落呈圓形，半透明，表面光滑，邊緣整齊。

3．4．2 菌株的形態及生理生化特性

由表2可以看出菌株ZZU M5-2可以耐受10℃低溫，而在45、50℃高溫及5℃低溫條件下生長能力微弱;在 pH 4．0～9．0可以生長良好;可以耐受 3．5%的鹽濃度。

表2 菌株形態及生理生化特性鑒定結果Table 2 The results of strain shape and microbiological identification

3．4．3 16S rDNA 序列分析

將測得的16S rDNA序列與通過Blast在Gen-Bank中檢測得到的標準菌株序列信息用CLUSTAL W軟件比對。采用鄰接法構建進化樹(neighbor-joining method)如圖3所示，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis被用作外圍菌株。

結合生理生化試驗及16S rDNA序列結果分析，ZZU M5-2被鑒定為Lactobacilluscurvatus．

圖3 ZZU M5-2的16S rDNA序列系統進化樹Fig．3 Phylogenetic tree of strain ZZU M5-2 based on 16S rDNA sequence

4 討論

實驗從發酵面團來源的乳酸菌中篩選到1株對單增李斯特氏菌有較強抑制作用的菌株ZZU M5-2，該菌株無細胞發酵上清液在經過酸排除及過氧化氫排除后依然有很強的抑菌活性，但這種抑菌活性在蛋白酶處理后消失，這與前人報道的細菌素情況一致［13］，因此推斷該菌株產生的能夠抑菌活性物質主要為細菌素。

乳酸菌種類繁多，不同的菌株產生的細菌素性質也不盡相同，S．Oh等人的實驗菌株Lactobacillus acidophilus 30SC所產生的細菌素在121℃處理20 min仍然保持50%的抑菌活性［14］，Yurong Gao等人從中國傳統發酵蔬菜中分離到的Lactobacillussake C2產生的細菌素sakacin C2在121℃處理20 min后仍然對Staphylococcus aureus ATCC 63589有80．9%的抑菌活性;本實驗篩選到的ZZU M5-2產生的細菌素在60和80℃熱處理后能保持穩定的抑菌活性，但在100℃時活性明顯下降，并在121℃活性完全消失;推測原因可能是本實驗篩選出的乳酸菌所產細菌素是蛋白質類細菌素，對熱敏感，在高溫條件下空間結構容易發生變化，從而失活導致抑菌活性降低;這類細菌素物質其分子質量較大(＞10kDa)［15］，在食品生產中常用的巴斯德滅菌溫度為62～65℃，時間為30 min，這對菌株ZZU M5-2產生的細菌素保持良好的抑菌活性沒有影響，因此其在食品加工中有良好的應用前景。

XIE等人從馬奶酒中分離到Lactobacillus plantarum LB-B1所產的細菌素在pH 2．0～8．0對Listeria monocytogenes保持穩定的抑菌活性，在pH為10．0時抑菌活性略有下降［16］。與之相似，本實驗篩選到的ZZU M5-2產生的細菌素在pH 2．0～8．0范圍內均有明顯的抑菌活性，但在pH 9．0時抑菌活性消失;其抑菌活性隨著pH值的減小而增強，且在pH 2．0時抑菌活性最大，這可能是因為過酸的原因，研究表明，單增李斯特氏菌不能在此pH下生長［2］。

將ZZU M5-2發酵上清液與單增李斯特氏菌共培養實驗結果進一步表明ZZU M5-2菌株發酵上清液中存在能抑制單增李斯特氏菌生長的活性物質，這與寧佳的實驗結果類似［2］，其在單增李斯特氏菌的對數早期加入乳酸片球菌P9發酵液雖然不能完全殺死指示菌，但可以明顯抑制生長。

本實驗測定出菌株ZZU M5-2所產細菌素分子量為25kDa，與前面推測結果相一致，進一步證實其細菌素類型為大分子蛋白質類細菌素。

在不同地區的發酵面團中，細菌的組成差別較大。其中河南地區以Lactobacillus為優勢菌，所占比例達40．704%［9］，與之相一致，本實驗從開封地區發酵面團樣品中分離出的產細菌素菌株ZZU M5-2鑒定為Lactobacillus curvatus，其所產細菌素的分離純化及作用機理等有待進一步研究。

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