分離自傳統發酵乳制品中具有優良發酵特性的保加利亞乳桿菌的篩選*

烏仁圖雅，德亮亮，扎木蘇，秦艷婷，陳紅霞，劉文俊，張和平，孟和畢力格

(內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重要實驗室，內蒙古呼和浩特，010018)

保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌是乳酸菌中最具有應用價值的菌種，尤其是在酸奶發酵中，常常作為發酵劑菌種。保加利亞乳桿菌在酸奶生產過程中的作用非常重要，是酸奶產品產黏、產香、產酸的主要菌種之一［1］。在酸奶發酵過程中通常采用德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)作為發酵劑菌種［2］。發酵劑發酵特性即產酸、產香、產黏、蛋白和脂肪分解、乳糖代謝和后酸化等直接關系到發酵乳制品的品質和特性。

保加利亞乳桿菌發酵特性主要包括:(1)產香特性。保加利亞乳桿菌在發酵過程中能夠產生特殊的香氣，主要是乳酸和羰基類化合物組成，例如:乙醛、丙酮、雙乙酰，其中乙醛是主要的風味物質，乙醛含量的多少決定了發酵乳的風味［3-4］。保加利亞乳桿菌是酸奶生產過程中主要產乙醛的菌株，是由于保加利亞乳桿菌中的蘇氨酸醛縮酶活性要比嗜熱鏈球蘇氨酸醛縮酶活性菌強［5-6］;(2)產酸特性。保加利亞乳桿菌具有非常強的產酸能力和耐酸性，是酸奶發生后酸化的主要發酵劑菌株，在貯藏期間使酸奶的pH值持續下降，以致出現消費者不可接受的高酸度及感官質量下降的現象［7-8］。

在自然狀況下篩選出風味獨特、后酸化能力弱、活力較高的具有優良發酵特性的保加利亞乳桿菌是制備高效發酵劑和生產優質酸奶的關鍵環節和首要任務。近年來，劉娜等人［9］通過保加利亞乳桿菌對牛乳的pH值、滴定酸度、黏度、游離氨基氮和脫水收縮性等指標產生的影響進行分析，篩選出了具有優良發酵特性的保加利亞乳桿菌。高姝冉［10］也有類似報道。李延華等人［11］通過對發酵乳的風味成分進行分析，篩選出了發酵特性優良的保加利亞乳桿菌。另外，徐成勇等人［12］以保加利亞乳桿菌后酸化能力弱為依據，最終篩選出優良菌株。而優質的發酵劑不僅后酸化能力弱，且需風味獨特，因此，本實驗結合保加利亞乳桿菌的產酸特性和產香特性為依據篩選出具有優良發酵特性的保加利亞乳桿菌，為開發直投式酸奶發酵劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

試驗所用的11株發酵乳桿菌(IMAU20234，IMAU20775，IMAU20342，IMAU20360，IMAU20706，IMAU20295，IMAU20423，IMAU20136，IMAU20227，IMAU20404，ND02)從牧區傳統發酵乳制品中分離得到，現保藏于作者所在實驗室乳酸菌菌種資源庫;Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus ND02 為該實驗室以商業發酵劑公司Chr．Hansen的YC-X11中的德氏乳桿菌保加利亞亞種作為對照篩選出的具有優良發酵特性的菌株［13］，因此本研究以ND02為對照菌株。

1.2 原料與試劑

全脂奶粉(新西蘭恒天然集團)，乙醛檢測試劑盒 K-ACHYD(Megazyme，Ireland)，MRS(Man Rogosa Sharpe)液體、固體合成培養基(CM0785B，英國OXOID公司)，雙乙酰標品、三氯乙酸 (國藥集團化學試劑有限公司)等。

2 實驗方法

2.1 菌株的活化培養

將11株供試菌株于MRS液體培養基活化，并連續傳2代，采用MRS固體培養基傾注法，進行保加利亞乳桿菌活菌計數。

2.2 發酵乳樣品的制備

全脂復原乳(全脂粉11．5%、蔗糖6．5%)預熱至60℃然后高壓均質，95℃殺菌10 min，急冷之后按添加量5×106CFU/g接入發酵劑，置于42℃培養發酵至pH 4．5時終止發酵，置于4℃冰箱中后熟21 d。

2.3 保加利亞乳桿菌產酸特性試驗

2．3．1 菌株發酵時間的確定

發酵乳樣品從發酵開始到發酵乳pH值下降至4．5所需時間為發酵時間，在發酵期間，每隔4 h測定1次發酵乳樣品的pH值，當發酵乳pH值下降至4．5時終止發酵并確定其發酵時間。

2．3．2 貯藏期間發酵乳樣品pH值的測定

在后熟期間，分別在 0、8、12、24、36、48 h、7、14 d和21 d測定發酵乳pH值。取3個平行乳樣品，冷卻至17～20℃，采用pH計測量pH值。

2．3．3 貯藏期間滴定酸度的測定

后熟期間分別在 0、8、12、24、36、48 h、7、14 d 和21 d測定其滴定酸度。準確稱量5．00 g發酵乳樣品勻漿，至少取3個平行，置于100 mL三角瓶中，加入40 mL新煮沸冷卻至40℃(去CO2)水，再加入2滴0．5%的酚酞乙醇溶液作指示劑，輕輕搖勻，用0．1 mol/L的NaOH標準溶液滴定至微紅色在30 s內不消失為止。公式如下:

2.4 保加利亞乳桿菌產香特性試驗

一般在發酵結束后48 h之內保加利亞乳桿菌風味物質的產量達到最高值，之后隨著貯藏時間的延長而下降。其中乙醛在4℃冷藏后含量有較大變化，一般在12 h和24 h達到最高［14］。因此本研究在發酵乳后熟期間，分別在 0、8、12、24、36、48 h、7、14 d 和21 d測定發酵乳樣品中風味物質乙醛和雙乙酰的含量。

2．4．1 乙醛含量的測定

在后熟期間，分別在 0、8、12、24、36、48 h、7、14d和21 d采集樣品。按照以下操作進行乙醛含量測定:分別取5．00 g乳樣加0．5 mL 20%的檸檬酸、再加10 mL三蒸水、搖勻、室溫放置10 min，然后在4℃，4 000 r/min離心10 min取上清，用濾菌器過濾收集于1．5 mL EP管中。采用乙醛檢測試劑盒 KACHYD，具體方法參照試劑盒說明書。

2．4．2 雙乙酰的檢測方法

(1)發酵乳樣品前處理:取發酵乳樣15 mL，加15 mL16%的三氯乙酸溶液，混勻、室溫靜置10 min，然后在4℃，4 000 r/min離心10 min，將上清液用濾紙過濾1遍，以保證澄清。同時，用無菌的全脂乳作為對照。

(2)雙乙酰的測定:用微量進樣器吸取20 μL雙乙酰標準品，溶于蒸餾水中并定容至500 mL。取12支編號的試管分成 2 排放置，分別加 0．0、2．0、4．0、6．0、8．0、10．0 mL 的標準溶液各 2 管，并分別用蒸餾水補足10 mL，每管中分別加10 mL 16%的三氯乙酸，這時雙乙酰標準溶液的濃度分別為 0．0、4．0、8．0、12．0、16．0 和 20．0 μg/mL。第 1 排試管中加入0．25 mL 1%的鄰苯二胺溶液，第2排試管不加作為對照組;搖勻后置于黑暗處放置30 min。反應完成后加入 4．0 mol/L HCl終止反應，第 1排試管加 1．0 mL，第2排試管加1．25 mL，混勻后以第2排試管空白作為參比液，在335 nm波長下用石英比色皿測定吸光度值。以雙乙酰濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。取待測樣品，用16%的三氯乙酸溶液稀釋適當的倍數，重復上述過程，然后根據雙乙酰標準曲線可獲得待測樣品中雙乙酰質量濃度(μg/mL)。

3 實驗結果

3.1 發酵時間的確定

不同 Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus菌株從發酵開始至發酵終點(發酵乳pH 4．5時)所需要的時間如表1所示。

表1 不同Lb.delbrueckii ssp.bulgaricus菌株發酵乳發酵時間Table 1 Time required for yogurt fermentation with different Lb.delbrueckii ssp.bulgaricus strains

由表1可知，11株供試菌中3株(IMAU20136、IMAU20227、IMAU20404)發酵時間超過23 h，因此在后續試驗中篩除。其余7株菌的發酵時間基本集中在10～15 h，并且通過比較對照菌株ND02，其發酵用時為15．67 h，比8株菌都長。因此，根據菌株發酵所需的時間初步選定 IMAU20234、IMAU20775、IMAU20342、IMAU20360、IMAU20706、IMAU20295和IMAU20423可能會作為優良菌株。

3.1 貯藏期間pH值變化

圖1是由不同 Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus發酵的發酵乳在發酵終點0 h以及4℃條件下后熟8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、7 d、14 d 和21 d 的 pH 值變化。

圖1 不同Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus發酵乳樣品貯藏期間pH值的變化Fig．1 The pH values of fermented milk with different Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus strains during storage time

由圖1可知，貯藏0～48 h期間各菌株發酵乳的pH值變化趨緩，貯藏第7天時，菌株IMAU20706、IMAU20295和IMAU20423發酵乳pH值迅速下降。其中，IMAU20295發酵乳的pH值下降得最快，貯藏21 d時pH下降至3．65;這是由于后酸化能力強的保加利亞乳桿菌，發酵乳pH值3．8時仍能夠繼續生長，同時分解乳糖產生乳酸，導致發酵乳pH值持續下降，嚴重影響發酵乳質量［15］。對照菌株ND02發酵乳的pH值下降相對慢，貯藏第21天時pH值仍為4．20。菌株 IMAU20234、IMAU20775、IMAU20432 和IMAU20360發酵乳的pH值降的相對較慢，貯藏第21天時，發酵乳的 pH 值分別為 4．11、4．17、4．10 和4．08，表明后酸化能力較弱。

3.2 貯藏過程中滴定酸度變化

不同 Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus發酵的發酵乳滴定酸度在發酵終點0 h以及4℃條件下后熟8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、7 d、14 d 和21 d 如圖2 所示。

圖2 不同Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus發酵乳貯藏時間滴定酸度(TA)的變化Fig．2 The TA of fermented milk with different Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus strains during storage time

由圖2可知，貯藏過程中各菌株發酵乳的滴定酸度顯著升高(P＜0．05)。貯藏0～8 h內滴定酸度上升較快，是由于菌株發酵乳糖產酸較快。朱秋勁報道的發酵乳后熟12 h內是乳酸菌產酸的主要階段［16］，與本研究的結論基本一致。貯藏前12～48 h內，各菌株發酵乳的滴定酸度增長趨緩。貯藏第7天時，菌株IMAU20706、IMAU20295和 IMAU20423發酵乳的酸度顯著高于其他菌株，該3株菌貯藏到21 d時發酵乳的酸度分別為 102．13、105．88 和 95．11 °T。對照菌ND02發酵產品的酸度僅為70．28°T，因此該3株菌的耐酸性強，產生的β-半乳糖苷酶活性好，能夠不斷產生乳酸，使發酵乳滴定酸度不斷升高，是后酸化能力較強的菌株。而菌株 IMAU20234、IMAU20775、IMAU20432和 IMAU20360貯藏到21 d時，發酵乳滴定酸度變化較小，表明這4株菌在貯藏期間的后酸化能力較弱。

3.3 發酵乳乙醛含量變化

乙醛是酸奶風味物質中最主要的成分，發酵乳中乙醛的含量是評價酸奶質量的重要指標之一。目前，國內生產的酸奶主要是以乙醛風味為主的醛香型酸奶。Handan［17］指出高含量乙醛是形成發酵乳良好風味的前提，在5～21 μg/g范圍內乙醛含量越高對發酵乳的風味越有利。Sandine等［18］報道過，在發酵乳中乙醛的濃度只有高于8 μg/g時，才能產生具有良好風味的發酵乳。劉寧寧［19］等人研究報道發酵乳乙醛含量5 mg/L可品嘗到，質量含量超過30 mg/L時，會使酸奶產生不愉快的風味。本研究乙醛含量測定結果如圖3所示。

圖3 不同Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus發酵乳貯藏時間乙醛產量的變化Fig．3 The acetaldehyde content of Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus strains during storage time

從圖3可以看出，發酵乳乙醛含量24～36 h內達到峰值，之后隨著貯藏時間的延長而下降。Beshkova報道，發酵乳乙醛含量后熟期間一直處于增長狀態，在22 h達到其峰值，而不同菌株，其含量達峰值時間有一定差別，大致在22～31 h［6］，本研究所得結論基本與此一致。菌株IMAU20706和IMAU20295分別在貯藏 24、36 h時達到峰值(含量為 41．53、48．61 μg/g)，貯藏期間第7天其乙醛含量仍在30 μg/g以上。這2株菌乙醛含量過高，對酸奶風味不利，會使酸奶產生不愉快的風味。對照菌ND02乙醛含量變化在4．39～9．69 μg/g之間。菌株IMAU20234、IMAU20775、IMAU20432 和 IMAU20360乙醛含量變化在5～15 μg/g之內，認為是風味較好的菌株，尤其菌株IMAU20775乙醛含量變化在9．00～13．47 μg/g之間，高于菌株IMAU20234、IMAU20432和IMAU20360。而菌株IMAU20423乙醛含量在整個過程中都低于4 μg/g，該菌被認為是極弱風味菌種，不適合做發酵劑菌種。

3.4 發酵乳雙乙酰含量變化

不同 Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus發酵的發酵乳在發酵終點0 h以及4℃下后熟8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、7 d、14 d和21 d的雙乙酰含量如圖4所示。

圖4 不同Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus發酵乳貯藏時間乙醛產量的變化Fig．4 The acetaldehyde content of Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus strains during storage time

從圖4可以看出，不同菌株發酵的發酵乳雙乙酰含量之間存在著差異，菌株雙乙酰含量隨貯藏時間的延長變化規律有所不同，菌株 IMAU20295、IMAU20423和ND02發酵乳雙乙酰含量發酵終點時達到峰值，隨著貯藏時間的延長下降，貯藏到21 d時又有 所 上 升。菌 株 IMAU20234、IMAU20775、IMAU20432、IMAU20360和 IMAU20706發酵乳雙乙酰含量隨著貯藏時間的延長上升達到峰值，然后開始下降，貯藏到第14天、21天時又有上升的趨勢，這與Marshall［20］報道，低pH有利于雙乙酰合成，本研究得出的結論與此一致。康歡［21］等也有類似報道，隨著pH的降低和酸度的增加，雙乙酰含量隨之增加。研究發現產品中2 μg/mL的雙乙酰即可表現出特有的奶油香味［22］，與對照菌株ND02比較，將在貯藏期間產雙乙酰量高于2 μg/mL，且在后熟期間含量較穩定的菌株為IMAU20775，是開發商業發酵劑的潛在菌株。

4 結論

通過對11株保加利亞乳桿菌菌株在發酵乳發酵過程以及4℃貯藏 0、8、12、24、36、48 h、7、14 d和21 d期間的pH值、滴定酸度，產乙醛和雙乙酰能力等一系列指標的測定及評價，同時記錄每種保加利亞乳桿菌的發酵時間并對測定的結果進行分析，篩選出1株發酵特性優良的菌株IMAU20775，其發酵時間較短(12．38 h);后酸化能力較弱，4℃貯藏21d后滴定酸度的僅為70．56°T;產乙醛能力較好，發酵乳乙醛含量變化在9．00～13．47 μg/g;另外，發酵乳后熟期間產雙乙酰含量在 1．85～3．04 μg/mL 之間，且較穩定。IMAU20775所具有的優良發酵特性可作為研制開發優良發酵乳及發酵飲料的發酵劑菌種。

［1］白衛東，趙文紅，梁桂鳳，等．保加利亞乳桿菌的特性及其應用［J］．中國釀造，2009(8):10-14．

［2］Tamime A Y．Fermented milks:a historical food with modern applications-a review［J］．European Journal of Clinical Nutrition，2002，56(4):2-15．

［3］Ayhan K，Fugen D O，Tunail N．Commercially important characteristics of Turkish origin domestic strains of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii ssp．bulgaricus［J］．International Journal of Dariy Technology，2005，58(3):150-157．

［4］van Kranenburg R，Kleerebezem M，van Hylckama V J，et al．Flavour formation from amino acids by lactic acid bacteria:predictions from genome sequence analysis［J］．International Dairy Journal，2002，12(2):111-121．

［5］Bongers R S，Hoefnagel M H N，Kleerebezem M．Highlevel acetaldehyde production in Lactococcus lactis by metabolic engineering［J］．Applied and Environmental Microbiology，2005，71(2):1 109-1 113．

［6］Beshkova D，Simova E，Frengova G，et al．Production of flavour compounds by yogurt starter cultures［J］．Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，1998，20(3):180-186．

［7］O’Sullivan E，Condon S．Relationship between acid tolerance，cytoplasmic pH，and ATP and H+-ATPase levels in chemostat cultures of Lactococcus lactis［J］．Applied and Environmental Microbiology，1999，65(6):2 287-2 293．

［8］郭清泉，張蘭威，夏秀芳．酸奶制品發生后酸化主要發酵劑菌確定及性質研究［J］．食品與發酵工業，2002，28(4):24-27．

［9］劉娜，邵玉宇，烏蘭，等．具有優良發酵特性的德氏乳桿菌保加利亞亞種的篩選［J］．中國乳品工業，2013，41(7):7-11．

［10］高姝冉，邵玉宇，郭慧玲，等．德氏乳桿菌保加利亞亞種優良菌株的篩選［J］．乳業科學與技術，2013，36(4):1-6．

［11］李延華，王偉軍，張蘭威，等．德氏乳桿菌保加利亞亞種發酵乳風味成分分析［J］．食品科學，2009，30(4):257-259．

［12］徐成勇，吳昊，鄭思聰，等．弱后酸化酸奶發酵劑的篩選［J］．中國乳品工業，2013，35(3):12-16．

［13］烏蘭．酸乳發酵劑菌株的篩選［D］．呼和浩特:內蒙古農業大學，2011:5-26．

［14］王琴，朱小紅，任遠慶，等．不同乳酸菌及其組合發酵乳的產香特性［J］．食品工業科技，2008，29(6):75-76．

［15］郭清泉．酸奶制品在貯存過程發生后酸化的機理及控制措施的研究［D］．哈爾濱:東北農業大學，2001:16-18．

［16］朱秋勁，王電，陳廷昌．酸奶加工的全程物理性質變化的研究［J］．食品與科學，2003，24(2):44-48．

［17］Hamdan I Y，Kunsman Jr J E，Deane D D．Acetaldehyde production by combined yogurt cultures［J］．Journal of Dairy Science，1971，54(7):1 080-1 082．

［18］Routray W，Mishra H N．Scientific and technical aspects of yogurt aroma and taste:a review［J］．Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2011，10(4):208-220．

［19］劉寧寧，郭紅敏，葛春美，等．酸奶中乙醛和雙乙酰含量對其風味的影響［C］．上海:第十六屆中國國際食品添加劑和配料展覽會，2012年3月28日．

［20］Marshall V M．Lactic acid bacteria:starters for flavor［J］．FEMS Microbiology Letters，1987，46(3):327-336．

［21］康歡，鄭遂，王偉，等．4株嗜熱鏈球菌產酸和產香力的比較與分析［J］．食品科技，2013，38(1):13-17．

［22］Hegazi F Z，Abo-Elnaga I G．Production of acetoin and diacetyl by lactic acid bacteria in skimmed milk with added citrate and pyruvate［J］．Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung and Forschung，1980，171(5):367-370．