雙歧桿菌、酪酸梭菌及谷氨酰胺對慢性應激模型小鼠腸黏膜屏障的影響*

王玉玉，張 軍 ，鄭鵬遠 ，李付廣，劉志強，陳東暉

1)鄭州大學第二附屬醫院消化內科 鄭州450014 2)鄭州大學第二附屬醫院藥劑科 鄭州450014 3)鄭州大學基礎醫學院微生物學與免疫學教研室 鄭州450001 4)深圳市耳鼻咽喉研究所 深圳518000

#通訊作者，張軍，女，1955年1月生，副教授，副主任藥師，研究方向:安全用藥、合理用藥，E－mail:zdefyzj@163.com;鄭鵬遠，男，1965年2月生，博士，教授，主任醫師，研究方向:胃腸道感染與免疫，E－mail:medp7123@126.com

應激是機體對外界刺激的非特異性適應性反應，長期處于應激狀態會引發機體的各種應激性疾病，如腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)。目前認為IBS 的發病是多因素的，涉及胃腸動力異常、內臟敏感性異常和心理因素等。腸黏膜屏障的完整性缺失與IBS 黏膜免疫活化和腸道功能失調有關［1］。IBS 亞群患者腸通透性存在異常，且與內臟高敏和排便習慣有關［2－3］。研究［4］表明IBS 患者黏膜屏障的結構、功能異常與臨床癥狀有關，提示腸黏膜屏障在IBS 發病中發揮重要作用。雙歧桿菌可緩解應激大鼠腸道細菌移位、腸道通透性改變等現象;酪酸梭菌分泌的酪酸是結腸細胞優先利用的能源物質;谷氨酰胺廣泛應用于臨床營養，已證明可以改善多種疾病狀態的腸黏膜屏障，降低腸道通透性［5－6］。作者采用避水實驗誘導小鼠慢性應激模型，應用雙歧桿菌、酪酸梭菌和谷氨酰胺進行治療，評價其對小鼠腸道通透性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 SPF 級Balb/c 小鼠60 只，雄性，6～8 周齡，體重(20±2)g，購自鄭州大學實驗動物中心，小鼠自由攝取標準飲食和水，適應環境1周，溫度20～26℃，濕度(50±10)%。雙歧桿菌、酪酸梭菌菌粉由山東科興生物制品有限公司惠贈，谷氨酰胺購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2 雙歧桿菌、酪酸梭菌懸液及谷氨酰胺藥液的配制 雙歧桿菌、酪酸梭菌菌粉用無菌生理鹽水配成1×107CFU/mL 懸液。谷氨酰胺用無菌生理鹽水溶解，按人與小鼠之間的用藥劑量換算，配制成質量濃度為40 g/L 的藥液備用。

1.3 實驗動物分組及應激模型的建立 應用隨機數字表法將60 只小鼠分為6組:正常對照組、模型對照組、雙歧桿菌干預組、酪酸梭菌干預組、谷氨酰胺干預組、聯合干預組。正常對照組和模型對照組分別用生理鹽水0.5 mL 灌胃，雙歧桿菌干預組用0.5 mL 雙歧桿菌1×107CFU/mL 灌胃，酪酸梭菌干預組用0.5 mL 酪酸梭菌1×107CFU/mL 灌胃，谷氨酰胺干預組用0.5 mL 40 g/L 谷氨酰胺灌胃，聯合干預組各用0.5 mL雙歧桿菌1×107CFU/mL+ 0.5 mL 40 g/L 谷氨酰胺灌胃。每日9:00 給藥一次，各干預組均從造模開始前4 d 開始連續給藥，直至造模結束。根據既往方法建立避水實驗模型［7］:每日稱質量給藥后，除正常對照組外其余各組動物均放置到10 cm×10 cm的平臺上，平臺固定在直徑為100 cm、深25 cm 的有水塑料容器內，離水面的距離為2 cm。每天放置2 h(上午9:00～11:00)，連續10 d。

1.4 小鼠腸道通透性測定 血清D－乳酸和二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)含量可反映腸黏膜的通透性。造模結束后用眼眶靜脈叢采血法取血，用ELISA 法測定各組小鼠血清D－乳酸和DAO 的含量。ELISA 試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.5 腸道閉鎖小帶(zonula occluden-1，ZO-1)、閉合蛋白(Occludin)mRNA 表達的RT-PCR 檢測在GenBank 中查找目的基因序列，由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并合成相關引物(表1)。Trizol 法提取小腸、結腸組織總RNA 進行RTPCR。PCR 反應體系:cDNA 模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。PCR 反應條件:94℃預變性5 min;94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，共30 個循環;72℃延伸5 min，4℃保存。取擴增產物行20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，采用溴化乙錠染色，用凝膠成像分析儀分析條帶的灰度值，以目的基因與內參β－actin 條帶平均灰度值的比值表示目的基因的表達水平。

表1 引物的序列及產物大小

1.6 腸道ZO-1、Occludin 蛋白表達的Western blot 檢測 取小腸、結腸組織100 mg，加入蛋白裂解液制備蛋白樣品。SDS－PAGE 凝膠電泳1 h，轉膜。室溫封閉1 h。一抗(鼠抗ZO－1、Occludin 多克隆抗體，購自北京奧博森生物技術有限公司)均按1∶300稀釋，4℃孵育1 h。二抗4℃孵育1 h，顯色。用成像掃描分析系統分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內參β－actin 條帶平均灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0 進行分析，應用單因素方差分析和LSD－t 檢驗比較各組小鼠血清D－乳酸、DAO 含量和ZO－1、Occludin mRNA 及蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組小鼠腸道通透性測定 見表2。與正常對照組相比，模型對照組、各干預組血清D－乳酸、DAO 含量顯著升高;與模型對照組相比，正常對照組、各干預組血清D－乳酸、DAO 含量顯著下降。

表2 各組小鼠血清D-乳酸、DAO 檢測結果(n=10)μg/L

2.2 各組小鼠腸道ZO-1、Occludin mRNA 及蛋白表達的比較 見表3、4，圖1、2。

表3 各組小鼠小腸ZO-1、Occludin 的表達(n=10)

表4 各組小鼠結腸ZO-1、Occludin 的表達(n=10)

圖1 各組小鼠腸道ZO-1、Occludin mRNA 的表達

圖2 各組小鼠腸道ZO-1、Occludin 蛋白的表達

結果顯示模型對照組、各干預組小腸、結腸的ZO－1、Occludin mRNA 和蛋白表達量較正常對照組顯著降低;各干預組小腸、結腸ZO－1、Occludin mRNA 和蛋白表達較模型對照組均顯著升高。

3 討論

腸黏膜屏障形成分隔腸腔與內環境的物理屏障，腸上皮屏障結構和功能完整性的缺失利于食物和細菌抗原的自由滲透，刺激破壞性的免疫反應和黏膜炎癥的發展，參與多種疾病的發病，如IBS。腸道機械屏障中的緊密連接是決定腸道通透性的重要因素，緊密連接蛋白數量和分布的改變直接影響腸道通透性。ZO 和Occludin 是重要的緊密連接蛋白。IBS 患者的腸黏膜屏障功能失調與結腸黏膜中ZO－1下調和蛋白酶介導的Occludin 降解有關。Occludin在腹瀉型－IBS 患者空腸腸上皮細胞的細胞質中顯著增加，提示Occludin 大量內化，而健康人Occludin 主要位于緊密連接處［8］。該實驗中也發現，應激小鼠小腸、結腸上皮ZO－1、Occludin 表達有不同程度減少。

益生菌可以抑制腸道通透性增高和內臟高敏性，從而改變腸道對應激的黏膜反應［9］，降低壓力誘導的結腸通透性增高［10］。該實驗中益生菌干預后，應激小鼠癥狀顯著改善，緊密連接蛋白ZO－1、Occludin 表達升高，腸道通透性也相應降低。有研究［11］表明，雙歧桿菌可以降低壞死性腸炎小鼠升高的腸道通透性，維持密封蛋白－4 和ZO 在緊密連接中的結構、位置。人體攝入多種益生菌后，可顯著減少糞便中連接蛋白的含量，提示腸道通透性降低。益生菌改變腸道通透性的機制之一可能是通過影響促腎上腺皮質激素釋放因子水平實現的［12］。有研究［13］報道，對急性應激大鼠應用益生菌干預2 周后，大鼠血漿促腎上腺皮質激素、皮質醇含量以及下丘腦脂多糖表達降低，結腸細胞間高通透性和門脈血中脂多糖水平的升高也有所緩解，但其具體的作用機制仍需更深入的研究。

谷氨酰胺是血液和體內游離氨基酸池中最豐富的氨基酸，它是小腸黏膜細胞、血管內皮細胞、淋巴細胞及惡性細胞等快速分裂細胞的重要能源物質。谷氨酰胺可能是維持腸道代謝、結構、功能基本的成分，特別是在腸黏膜屏障受損的情況下。谷氨酰胺缺陷可能會導致細胞膜通透性增加，補充谷氨酰胺則可以恢復腸道通透性。谷氨酰胺在臨床營養中應用廣泛，可以改善外科手術后、燒傷、放療、化療及胰腺炎等患者的腸黏膜，降低腸道通透性，從而減少腸道菌群易位，抑制促炎性細胞因子的產生［］。研究［15］發現腸道通透性增高的IBS 亞群患者出現谷氨酰胺合成水平下降。該實驗結果表明谷氨酰胺可明顯降低應激模型小鼠的腸道通透性及緊密連接蛋白的表達。

IBS 的臨床表現和發病機制均有異質性。雖然關于IBS 發病機制的研究進展迅速，但目前仍缺乏有效的治療手段。該研究結果顯示，雙歧桿菌聯合谷氨酰胺能較好恢復腸道緊密連接蛋白水平，降低腸道滲透性，恢復腸黏膜屏障功能。該研究可望為IBS 的治療提供新的理論依據。

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