Matrigel膠對大鼠海馬神經干細胞增殖及分化的影響*

鄧 鑫，宋來君，郭新賓

鄭州大學第一附屬醫院神經外科鄭州450052

#通訊作者，男，1952年9月生，教授，主任醫師，研究方向:神經外科的基礎與臨床，E－mail:laijunsong@126.com

神經干細胞(neural stem cells，NSCs)是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細胞，可以通過不對等的分裂方式產生神經組織的各類細胞，如神經元細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞等［1］，周圍外環境可對其分裂增殖以及分化等產生顯著影響。以往對神經干細胞的體外培養通常采用普通平面培養方式，與其體內生長環境有較大差異。Matrigel 膠是從富含胞外基質蛋白的EHS 小鼠腫瘤中分離出的一種細胞外基質，包含如層連接蛋白、Ⅳ型膠原等細胞外基質［2］，可構建適于細胞生長的三維立體支架。Irons 等［3］將神經元和星形膠質細胞嵌入到Matrigel 膠基底膜基質中，構建適于細胞生長的三維平臺，結果顯示Matrigel 膠中的神經元伸出長的突起，表達成熟神經元特異性的細胞骨架蛋白，且用膜片鉗檢測到了電生理學信號，表明了功能性突觸的形成。同樣有研究［4］表明，Matrigel 膠有助于雪旺細胞的延伸和生長。作者通過將體外培養的海馬NSCs 接種于Matrigel 膠內，觀察Matrigel 膠形成的立體支架對于NSCs 的影響，以研究立體培養對于NSCs 增殖及分化的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 出生24 h 內的SD 大鼠，SPF 級，雌雄不限，由鄭州大學實驗動物中心提供。DMEM/F12 培養基(Hyclone 公司)，B27 Supplement(50×，Gibco 公司)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，Invitrogen 公司)，表皮細胞生長因子(EGF，Gibco公司)，青-鏈雙抗(Solarbio 公司)，小鼠抗大鼠巢蛋白(Nestin)單克隆抗體、羊抗大鼠膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)單克隆抗體(Santa Cruz 公司)，兔抗大鼠β-tubulinⅢ蛋白單克隆抗體(EPITOMICS 公司)，SABC 標記山羊抗小鼠IgG多克隆抗體、SABC-HRP、SABC-FITC(武漢博士德公司)，Dylight594 標記驢抗羊多克隆抗體、FITC 標記驢抗兔多克隆抗體(Immunoreagents 公司)。Matrigel 膠(美國BD 公司)訂購于2013年3月，有效期3 個月，冰上融化分裝為1 mL 后置于－20℃保存。

1.2 NSCs 的培養 取新生SD 大鼠，乙醇消毒后于超凈工作臺內去頭處死，取海馬區腦組織剪碎，胰蛋白酶消化8 min 后加入胎牛血清終止，輕柔吹打后以1 200 r/min離心4 min，棄上清，沉淀以PBS 混懸液吹打、離心，重復2 次后以正常培養基(DMEM/F12 培養基按體積比1∶50 比例加入B27 Supplement 和20 ng/L bFGF、20 ng/L EGF、40 U/mL 肝素)混懸，200 目篩網過濾后進行細胞計數，以1×106mL－1接種25 cm2培養瓶中，置37℃、體積分數5% CO2培養箱中培養。每天觀察，每3 d 換液1 次。原代培養7 d 后進行傳代，傳代后每3 d 換液1 次，每7 d 傳代1 次。

1.3 NSCs 的鑒定 將傳至第3 代的細胞接種至包被多聚賴氨酸的24 孔板中，過夜后去除培養基，PBS沖洗3 次后用多聚甲醛固定，4℃過夜，吸棄多聚甲醛，PBS 沖洗5 min，連續3 次后加入體積分數3%H2O2甲醇溶液作用10 min，PBS 沖洗5 min(3 次)，吸去PBS，加入50 g/L BSA 室溫封閉1 h 后吸去BSA，加入以抗體稀釋液稀釋至1∶200 的小鼠抗大鼠Nestin 蛋白單克隆抗體(對照組僅加入抗體稀釋液)，4℃過夜后，吸棄抗體，PBS 沖洗5 min，連續3 次，加入SABC 標記山羊抗小鼠IgG 多克隆抗體(1∶100 稀釋)，37℃30 min 后，吸棄抗體，PBS 沖洗5 min，連續3 次，加入SABC-HRP 作用20 min，PBS 沖洗5 min，連續4 次后，加入DAB 顯色液顯色，顯微鏡下控制顯色，約2 min 后吸棄顯色液，鏡下觀察，拍照。

1.4 NSCs 的接種培養 24 孔板第1、2 排12 孔內加入200 μL 多聚賴氨酸靜置過夜包被。將傳至第3 代的NSCs 吹打混勻，取一半均勻接種至包被多聚賴氨酸的孔內;另一半1 200 r/min 離心4 min，離心管內保留0.5 mL 上清液，玻璃吸管輕柔吹打混勻后與2 mL Matrigel 膠混勻，以200 μL/孔接種于第3、4排孔內。接種完成后放入培養箱內培養3 h，顯微鏡下觀察神經球貼壁、Matrigel 膠凝固后去除原培養基，在第1、3 排孔內加入正常培養基，分別標記為A組、C組;第2、4 排孔內加入血清培養基(DMEM/F12 培養基+體積分數10%胎牛血清)，分別標記為B組、D組，置37℃、體積分數5% CO2培養箱中培養，每天換液，連續培養1 周。

1.5 NSCs 接種培養后細胞中Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP 蛋白的免疫熒光染色檢測 NSCs 接種1 周后，吸棄培養基，40 g/L 多聚甲醛固定過夜后，4組各取6 孔，分別進行Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP 蛋白免疫熒光染色，一抗均按1∶200 稀釋，并以DAPI進行細胞核染色后，在200 倍熒光顯微鏡下觀察、拍照。通過Image-Pro Plus 6 軟件分析所得圖片，以陽性熒光染色細胞個數比DAPI 藍色熒光染色的細胞核個數，得到陽性率。

1.6 統計學處理 采用SPSS 16.0 進行分析，應用2×2 析因設計的方差分析比較4組NSCs 中Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP 蛋白免疫熒光染色陽性率的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 NSCs 的培養及鑒定結果 顯微鏡下觀察，原代提取細胞剛接種時呈單個懸浮圓形細胞，邊界清楚，胞核大，胞質折光性強(圖1A);3 d 后開始出現小的細胞球，由5～8 個細胞組成(圖1B);原代培養4～5 d，細胞球增大，形成約幾十個細胞組成的細胞球(圖1C);第7 天左右，形成約幾百個細胞組成的細胞球(圖1D)。NSCs 傳代后形成單細胞和少量小細胞球組成的細胞懸液，傳代第2～3 天小細胞球形成，至第5 天形成約幾百個細胞組成的細胞球。第3 代細胞經Nestin 免疫細胞化學染色后，鏡下可見神經球大部分細胞胞質深棕色染色，呈陽性(圖2A)，對照組神經球細胞呈淡黃色(圖2B)。免疫細胞化學染色顯示神經球內細胞Nestin 蛋白高表達，證實為NSCs。

圖1 海馬NSCs 形態學觀察(A:×200;B、C、D:×400)

圖2 Nestin 免疫細胞化學染色結果(SABC-HRP 法，×400)

2.2 4組NSCs 第3 代細胞培養結果 A組NSCs貼壁后，分化較為緩慢，遷出細胞較其他3組少，神經球結構保留，遷出細胞以神經球為中心沿孔底平面放射狀遷出(圖3A);B組細胞分化迅速，神經球結構大多消失，分化細胞形成平面的網狀結構(圖3B);C組細胞分化較A組明顯，遷出細胞明顯增多，神經球結構存在，較A組偏小，遷出細胞以神經球為中心，向各方向立體放射(圖3C);D組細胞分化明顯，神經球結構消失，形成立體的網狀結構(圖3D)。

2.3 4組NSCs 中Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP 蛋白表達的比較 見圖4、表1。

圖3 4組NSCs 形態學觀察(×200)

圖4 Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP 蛋白免疫熒光染色結果

表1 4組NSCs 中Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP 蛋白的表達(n=6)%

3 討論

干細胞最早接觸的細胞外基質就是基底膜，在胚胎發育中，基底膜成分是最早合成的細胞外基質，在二細胞期就有Lamrnin 表達。Lamrnin 是一種可溶性的大分子糖蛋白，分布在細胞外基質中，其分子上存在某些細胞表面粘附分子的結合位點，以此促進細胞的粘附、生長與分化［5］，眾多體外培養實驗證明，Lamrnin 可以促進軸突的生長，被廣泛地應用于引導軸突損傷后的定向生長、再生，以及細胞的遷移等組織工程研究［6］。Lamrnin 是Matrigel 膠中主要的促進分化的因子。Matrigel 膠能促進很多不同類型的細胞系或原代培養細胞在形態學上和基因表型中表現出分化的表型［7］。有研究［8-9］報道Matrigel 膠中細胞分化的情況與具體的細胞種類有關，細胞與細胞間可發生三維立體聯系，組成與組織來源近似的結構。此外，Matrigel 膠還含有多種細胞外基質、蛋白酶和生長因子等，均能參與調節細胞的生長、分化、遷移，且Matrigel 膠的最大優點在于其組成成分以及比例與體內基質膜相同，可以塑造與體內相似的生長環境，是理想的體外培養平臺。

作者在實驗中應用Matrigel 膠為NSCs 創造三維立體培養環境，以觀察在模擬體內環境的條件下NSCs 的生長與分化情況。Nestin 是一種中間絲類型的蛋白，能夠特異性地表達在神經上皮干細胞上［10-11］。A組采用多聚賴氨酸促使NSCs 貼壁，添加正常培養基培養，細胞球結構仍保留完好，部分細胞因貼壁遷出細胞球分化，Nestin 免疫熒光染色大多數細胞呈陽性反應，表明細胞分化程度低，仍存在細胞增殖。B組細胞同樣采取多聚賴氨酸促使NSCs 貼壁，并添加體積分數10%胎牛血清誘導分化，細胞球結構迅速解離，Nestin 免疫熒光染色僅少量細胞呈陽性反應，表明細胞分化迅速完全。C組NSCs 接種到Matrigel 膠內，與A組相比，Nestin 染色陽性細胞集中于細胞球中，遷出細胞明顯增多，大多呈Nestin 陰性，Nestin 陽性率低于A組，說明Matrigel 膠可能存在促進NSCs 分化的作用。D組NSCs接種到Matrigel 膠后給予胎牛血清促進分化，與B組相比，Nestin 陽性率提高，且存在較小的細胞球結構，表明Matrigel 膠在促進NSCs 分化的同時，可能能夠為NSCs 生長提供良好的生長環境，且存在一定的促進NSCs 增殖能力。

β-tubulinⅢ是一種微管蛋白，特異性地分布于神經元和睪丸細胞中，是一種理想的神經元標志物［12］。A組β-tubulinⅢ陽性細胞散在細胞球外，陽性率較低;B組則僅有少量細胞呈β-tubulinⅢ陽性;C組β-tubulinⅢ陽性細胞率高于A組，D組高于B組，表明Matrigel 膠可以促進NSCs 向神經元分化。

GFAP 是一種中間絲蛋白，其主要存在于星形膠質細胞內，可以作為膠質細胞的標志物。通過GFAP 免疫熒光染色比較，A組GFAP 陽性細胞主要分布于細胞球外，球內表達較少;B組則呈現大量GFAP 陽性細胞;C組GFAP 陽性率高于A組，表明Matrigel 膠可促進NSCs 分化;D組細胞GFAP 陽性率遠低于B組，表明Matrigel 膠促進NSCs 分化作用中，神經元誘導分化傾向要強于膠質細胞傾向。

綜上所述，Matrigel 膠可以為NSCs 的增殖與分化提供良好的三維支架支撐作用，使NSCs 立體生長，并能促進NSCs 的增殖與分化，且能夠誘導NSCs向神經元方向分化。因此，Matrigel 膠對于研究NSCs 的生長分化規律有實際的研究價值，并且在移植NSCs 治療的研究中具有廣闊的前景。

［1］Gage FH.Mammalian neural stem cells［J］.Science，2000，287(5457):1433

［2］Kleinman HK，McGarvey ML，Hassell JR，et al.Basementmembrane complexes with biological-activity［J］.Biochemistry，1986，25(2):312

［3］Irons HR，Cullen DK，Shapiro NP，et al.Three-dimensional neural constructs:a novel platform for neurophysiological investigation［J］.J Neural Eng，2008，5(3):333

［4］Dewitt DD，Kaszuba SN，Thompson DM，et al.Collagen Ⅰ-matrigel scaffolds for enhanced Schwann cell survival and control of three-dimensional cell morphology［J］.Tissue Eng Part A，2009，15(10):2785

［5］Patton BL，Miner JH，Chiu AY，et al.Distribution and function of laminins in the neuromuscular system of developing，adult，and mutant mice［J］.J Cell Biol，1997，139(6):1507

［6］Kleinman HK，Philp D，Hoffman MP.Role of the extracellular matrix in morphogenesis［J］.Curr Opin Biotechnol，2003，14(5):526

［7］Kleinman HK，Martin GR.Matrigel:basement membrane matrix with biological activity［J］.Semin Cancer Biol，2005，15(5):378

［8］Li ML，Aggeler J，Farson DA，et al.Influence of a reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1987，84(1):136

［9］Baker JH，Huxham LA，Kyle AH，et al.Vascular-specific quantification in an in vivo Matrigel chamber angiogenesis assay［J］.Microvasc Res，2006，71(2):69

［10］Zhu J，Gu H，Yao Z，et al.The nestin-expressing and nonexpressing neurons in rat basal forebrain display different electrophysiological properties and project to hippocampus［J］.BMC Neurosci，2011，12:129

［11］Xu R，Wu C，Tao Y，et al.Nestin-positive cells in the spinal cord:a potential source of neural stem cells［J］.Int J Dev Neurosci，2008，26(7):813

［12］Graham V，Khudyakov J，Ellis P，et al.SOX2 functions to maintain neural progenitor identity［J］.Neuron，2003，39(5):749