應用酵母雙雜交系統篩選與TRF1相互作用的蛋白質*

王偉瓊，王 沖，劉延方，郝倩倩，馬 杰

鄭州大學第一附屬醫院血液科 鄭州450052

#通訊作者，男，1962年5月生，教授，主任醫師，研究方向:血液系統惡性腫瘤的基礎及臨床，E-mail:liuyanfang@zzu.edu.cn

端粒重復序列結合蛋白1(telomeric repeat binding factor 1，TRF1)是第一個被鑒定出來的端粒結合蛋白。TRF1 由439 個氨基酸組成，通過抑制端粒酶和端粒末端的接近程度負向調控端粒的長度。在端粒酶陽性細胞中，過表達TRF1 將導致端粒長度的縮短，而TRF1 的功能缺失突變體則會導致端粒長度不正常的增加［1］。作者的前期研究［2］發現:在有絲分裂期，TRF1 能夠定位于中心體且用siRNA 沉默TRF1 能夠導致多極紡錘體的出現，但TRF1 通過何種作用機制參與細胞周期的調控尚不清楚。該研究中，作者采用酵母雙雜交方法尋找與TRF1 相互作用的蛋白，為探討TRF1 在細胞有絲分裂期的調控機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 人宮頸癌HeLa 細胞株由鄭州大學血液病研究所保存。含有Flag 標記的p3XFLAG-myc-TRF1 真核表達質粒由洛克菲勒大學Tetia de Lange 教授惠贈。胎牛血清購自Hyclone 公司，青、鏈霉素，DMEM 培養基及蛋白A 和蛋白G 瓊脂凝膠珠購自Invitrogen 公司，胰蛋白酶購自華美(SABC)公司。鼠抗Myc 單克隆抗體、鼠抗GST 單克隆抗體購自Cell Signaling 公司，鼠抗TRF1 單克隆抗體購自Abnova 公司，鼠抗SAM68 單克隆抗體購自Abcam 公司，羅丹明偶聯羊抗鼠IgG 抗體購自Jackson Immunoresearch 公司。AH109 酵母菌種以及pGBKT7、pEGST-C3 質粒均由鄭州大學血液病研究所保存。人HeLa 細胞cDNA 文庫、MatchmakerTMGAL4 Two-Hybrid System 3 試劑盒購自Clontech 公司，限制性內切酶EcoRⅠ、SalⅠ、T4 DNA 連接酶、pyrobest 酶及相關緩沖液購自TaKaRa 公司，LipofectamineTM2000 購自Invitrogen 公司。

1.2 TRF1 誘餌蛋白表達載體的構建及鑒定 以含有TRF1 全長的p3XFLAG-myc-TRF1 真核表達質粒為模板擴增TRF1 基因序列全長，測序后將TRF1全長片段亞克隆到酵母表達載體pGBKT7，少量提取質粒;EcoRⅠ和SalⅠ酶切鑒定并測序證實。同法獲得pGBKT7-TRF1 和pEGST-TRF1 重組質粒。將pGBKT7(陽性對照)和pGBKT7-TRF1 分別轉化AH109感受態酵母菌，接種于SDP/-Leu 培養板，30℃培養觀察，免疫印跡實驗檢測TRF1 蛋白的表達。

1.3 酵母雙雜交［3］實驗 以pGBKT7-TRF1 為誘餌質粒篩選人HeLa 細胞cDNA 文庫，共篩選1×108個cDNA，經β-半乳糖苷酶活性測定以及2 輪SD/-Trp/-Leu/X-α-gal 培 養 板 和2 輪SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/ X-α-gal 培養板篩選后，將陽性克隆提取質粒，進行PCR 反應，將PCR 產物大小一致的質粒行酶切以排除重復質粒，進一步經核苷酸序列測定，并與GenBank 數據庫進行同源性比較。

1.4 免疫共沉淀實驗 收集HeLa 細胞，加入RIPA緩沖液進行裂解，取2%的細胞裂解液作為樣品對照，剩余部分均分為2 份，1 份加入正常小鼠血清及蛋白A 和蛋白G 瓊脂凝膠珠(空白對照)，1 份加入正常小鼠血清、蛋白A 和蛋白G 瓊脂凝膠珠及1 μg鼠抗TRF1 單克隆抗體(免疫共沉淀組)，搖床上4℃旋轉過夜孵育以捕獲目的蛋白。將蛋白裂解物及免疫共沉淀復合物用上樣緩沖液加熱變性，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗TRF1 單克隆抗體和鼠抗SAM68 單克隆抗體檢測，再以相應二抗孵育后，用ECL 發光底物壓片顯影。

1.5 體外沉降實驗 GST 融合蛋白及GST-TRF1融合蛋白的體外表達及純化參照Qiagen 公司重組GST 蛋白純化樹脂說明書操作。體外沉降實驗操作步驟參照文獻［3］進行，共分為3組進行檢測:HeLa細胞裂解液經RIPA 緩沖液預清除后，首先取20 μL裂解液作為內參對照(內參對照組)，再分別與GST對照蛋白(GST 對照蛋白組)和GST-TRF1 融合蛋白(GST-TRF1 融合蛋白組)共同孵育，隨后以SDSPAGE 電泳分離產物后，以抗GST 單克隆抗體及抗SAM68 單克隆抗體進行免疫印跡分析。

2 結果

2.1 TRF1 誘餌蛋白表達載體的構建 pGBKT7-TRF1 雙酶切結果見圖1。pGBKT7-TRF1 轉化菌株生長良好，與pGBKT7 轉化菌株生長速度無明顯差異，表明TRF1 蛋白對AH109 酵母菌沒有毒性。免疫印跡實驗證實pGBKT7-TRF1 能在AH109 酵母菌中正確表達，見圖2。

2.2 酵母雙雜交篩選結果 經酵母雙雜交最終篩選出5 個與人TRF1 相互作用的蛋白，分別是人SAM68 蛋白、Cullin1 蛋白、Polo-like kinase 1(Plk1)蛋白、Hsp70 以及activating transcription factor/cAMP responsive element binding protein(ATF5 蛋白)。

2.3 SAM68 與TRF1 的免疫共沉淀和體外沉降實驗結果 在HeLa 細胞株中，內源性TRF1 能夠與SAM68 抗體發生共沉淀反應，形成復合物，而與空白對照血清無結合(圖3)，表明TRF1 與SAM68 可能在細胞內相互結合。GST-TRF1 能夠與SAM68 相結合，形成復合物，而GST 蛋白則不能將SAM68 沉淀下來(圖4)，提示TRF1 與SAM68 能夠在體外相互結合。

圖1 重組質粒pGBKT7-TRF1 的鑒定

圖2 pGBKT7-TRF1 在酵母菌AH109 中的表達

圖3 SAM68 與TRF1 結合的免疫共沉淀結果

圖4 TRF1 與SAM68 的體外沉降實驗

3 討論

酵母雙雜交系統是以酵母遺傳系統為基礎，研究反式作用因子之間的相互作用對真核基因轉錄調控影響的一種技術。其最有價值的應用是用BD-X篩選由AD-Y 構成的cDNA 文庫，從而發現新的蛋白質之間的相互作用。該技術不僅可用于鑒定新的蛋白質相互作用，證實可疑相互作用，確定相互作用的結構域，而且可直接獲得編碼相互作用蛋白質的基因。

端粒是存在于真核生物線性染色體末端由核酸DNA 重復序列和蛋白質組成的特殊保護性結構，對于維持染色體的完整性和基因組的穩定性具有極其重要的生物學意義。端粒異常將導致染色體不穩定，而染色體的不穩定性與細胞衰老及腫瘤發生密切相關。端粒長度和結構的維持受端粒結合蛋白的調控。TRF1 是以端粒序列(TTAGGG)27 為探針，從HeLa 細胞核裂解產物中分離純化獲得的第一個人端粒雙鏈結合蛋白［1］，它以同源二聚體的形式直接與端粒雙鏈DNA 結合，通過調控端粒酶的活性以及端粒酶和端粒DNA 的接近程度，起到維持端粒長度與結構穩定的作用［4-5］。已有研究［6］顯示，TRF1在包括急性白血病在內的多種腫瘤中表達下調，而過量表達外源性TRF1 將促使細胞提前進入有絲分裂期并發生凋亡。另有研究［7］表明，TRF1 能夠參與細胞有絲分裂期的調控，在中心體形成的調控過程中發揮重要作用，但其具體作用機制及修飾途徑目前仍不清楚。

該研究中，作者采用酵母雙雜交系統，以pGBKT7-TRF1 為誘餌篩選人HeLa 細胞cDNA 文庫，成功篩選出一批TRF1 的新的結合蛋白，并首次發現SAM68 可以與TRF1 在體內和體外相互作用。SAM68 是一個RNA 結合蛋白，在RNA 的剪切和轉運過程中起調控作用［8］;此外，SAM68 在細胞有絲分裂調節以及腫瘤的轉移過程中亦起到重要的調節作用［9］。該項研究首次表明端粒結合蛋白TRF1 能夠與RNA 結合蛋白SAM68 發生相互作用，這為進一步研究端粒結合蛋白在細胞有絲分裂時相的調節及RNA 在調控和轉運過程中的功能提供了新的研究線索，也為進一步研究TRF1 對細胞周期和凋亡調控的影響提供了新的實驗證據。

綜上所述，作者鑒定出了5 個新的與TRF1 相互作用的蛋白質;通過體內及體外結合實驗證實了SAM68 是一個新的TRF1 結合蛋白。TRF1 有可能是一個新的連接端粒和細胞有絲分裂調控的通路蛋白，其可能通過與SAM68 的結合參與RNA 剪切及轉運過程的調控;選擇TRF1 作為基因治療的靶點，可能為腫瘤的靶向治療提供新的線索。

［1］van Steensel B，de Lange T.Control of telomere length by the human telomeric protein TRF1［J］.Nature，1997，385(6618):740

［2］Zhu Y，Wang C，Lan J，et al.Phosphorylation of Tara by Plk1 is essential for faithful chromosome segregation in mitosis［J］.Exp Cell Res，2012，318(18):2344

［3］王沖，余建，黃河.Plk1 磷酸化修飾PinX1 對宮頸癌He-La 細胞有絲分裂及凋亡的影響［J］.鄭州大學學報:醫學版，2013，48(3):323

［4］Chong L，van Steensel B，Broccoli D，et al.A human telomeric protein［J］.Science，1995，270(5242):1663

［5］Poulet A，Pisano S，Faivre-Moskalenko C，et al.The N-terminal domains of TRF1 and TRF2 regulate their ability to condense telomeric DNA［J］.Nucleic Acids Res，2012，40(6):2566

［6］Zhou XZ，Lu KP.The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is a potent telomerase inhibitor［J］.Cell，2001，107(3):347

［7］Zhu Q，Meng L，Hsu JK，et al.GNL3L stabilizes the TRF1 complex and promotes mitotic transition［J］.J Cell Biol，2009，185(5):827

［8］Itoh M，Haga I，Li QH，et al.Identification of cellular mRNA targets for RNA-binding protein Sam68［J］.Nucleic Acids Res，2002，30(24):5452

［9］Li Z，Yu CP，Zhong Y，et al.Sam68 expression and cytoplasmic localization is correlated with lymph node metastasis as well as prognosis in patients with early-stage cervical cancer［J］.Ann Oncol，2012，23(3):638