絞股藍總皂苷對光老化人皮膚成纖維細胞凋亡的影響*

王繼慧，張小卿，馬月丹，張 燚，馬賢德，吳景東

1)遼寧中醫藥大學基礎醫學院 沈陽110847 2)河南財政稅務高等?？茖W校對外經濟貿易系 鄭州451464 3)遼寧中醫藥大學針灸推拿學院 沈陽110847 4)遼寧中醫藥大學經濟管理學院 沈陽110847 5)遼寧中醫藥大學附屬第三醫院遼寧省肛腸醫院皮膚科 沈陽110003 6)遼寧中醫藥大學教學實驗中心 沈陽110847 7)遼寧中醫藥大學學生工作處 沈陽110847

#通訊作者，男，1962年10月生，博士，教授，研究方向:中醫美容、皮膚衰老與中藥抗皮膚衰老研究，E-mail:lnzywjd0719@163.com

人皮膚成纖維細胞是皮膚真皮層關鍵組成部分，可合成皮膚膠原蛋白。Leccia 等［1］首次發現長波紫外線(ultraviolet A，UVA)有誘導人皮膚成纖維細胞凋亡的作用。嚴重的UVA 照射后，人體細胞氧化應激和細胞凋亡均增加［2］。UVA 誘導的細胞凋亡被認為是機體穩態維持和DNA 損傷細胞清除的重要調節機制［3］。絞股藍味甘、微苦、性寒，歸脾、肺、腎三經，因可培補儲藏尤具調補脾肺之功，在抗皮膚老化中受到一貫的重視和應用［4-7］。絞股藍總皂苷(gypenosides，Gyp)為絞股藍主要藥理成分。作者通過觀測大鼠Gyp 含藥血清對UVA 誘導的光老化人皮膚成纖維細胞中凋亡相關基因和蛋白表達的影響，探討Gyp 調控細胞凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 人永生化皮膚成纖維細胞株HSF 購于上海艾研生物科技有限公司。Gyp(MUST-11031401)購于成都曼斯特生物科技有限公司，用生理鹽水配制成相應劑量備用。兔抗人Bax、Bcl-2 抗體、內參β-actin 抗體及HRP 標記的羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術有限公司，ECL 發光試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司。TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒為南京凱基生物科技發展有限公司產品，批號KGA7071。Trizol 由Invitrogen公司提供。Bax、Bcl-2 及內參GAPDH 引物由北京三博遠志生物科技有限公司合成，引物序列如下。Bax 上游引物序列 5'-AAGCTGAGCGAGTGTCT CAAG-3'，下游引物序列 5'-CAAAGTAGAAAA GGGCGACAAC-3'，產物大小178 bp。Bcl-2 上游引物序列5'-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAAC-3'，下游引物序列5'-AGACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3'，產物大小180 bp。內參GAPDH 上游引物序列5'-GT CAGTGGTGGACCTGACCT-3'，下游引物序列5'-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3'，產物大小420 bp。

1.2 實驗設備 PCR 儀、電泳儀為北京六一儀器設備廠產品。ChemiImager5500 型凝膠成像分析系統購自美國Alphainnotech Chemi Imager 公司。UVA光源(20 W)購自南京華強電子有限公司。

1.3 Gyp 含藥血清的制備 健康雄性SPF 級SD大鼠由中國醫科大學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(遼)2008-0005。用隨機數字表法將20只大鼠(體重200～250 g)分為空白血清組和低、中、高劑量含藥血清組4組，每組5 只。依據Meeh-Rubner 公式計算，低劑量含藥血清組大鼠Gyp 灌胃劑量80 mg/d，設定中高劑量組給藥量分別是低劑量組的2、4 倍，1 次/d，共灌胃7 d?？瞻籽褰M灌胃生理鹽水。第7 天灌胃結束1 h 后，經主動脈取血保存于促凝管內，室溫靜置1 h，2 000 r/min 離心10 min，收集上清。每組大鼠血清于同一離心管(50 mL)中混合，56℃水浴滅活，過濾滅菌，凍存備用。

1.4 光老化皮膚成纖維細胞模型的制備 參照陶冶等［8］建立光老化皮膚成纖維細胞模型。HSF 細胞用含體積分數10%胎牛血清和雙抗DMEM 培養基于37℃、體積分數5%CO2條件下培養，隔日用2.5 g/L 胰酶消化傳代。取對數生長期細胞，用2.5 g/L 胰酶消化后加入新鮮培養液制成細胞懸液，以1×104mL－1接種于25 cm2的培養瓶中，于37℃、體積分數5%CO2培養箱中培養48 h，棄去舊培養液，PBS 清洗3 次至無色，加入2 000 μL PBS，置于UVA 下照射。根據文獻［9］計算照射劑量，照射劑量=照射強度×照射時間。照射強度采用紫外線輻照計測量。最終照射劑量為36 J/cm2。

1.5 實驗分組 將模型細胞隨機分為5組，每組6瓶，分別為模型組、正常血清組和低、中、高劑量Gyp組。細胞經照射后，棄去PBS，模型組加入5 mL 新鮮培養液，正常血清組加入5 mL 含體積分數10%正常大鼠血清的新鮮培養液，低、中、高劑量Gyp組分別加入5 mL 含體積分數10%低、中、高劑量大鼠含藥血清的新鮮培養液。培養12 h 后，取細胞用于相關指標的檢測。以未照射的HSF 作為空白對照。

1.6 細胞凋亡的TUNEL 法檢測 細胞用PBS 漂洗2 次，周圍用吸水紙吸干，按TUNEL 法檢測試劑盒說明操作，用FITC 標記細胞，熒光顯微鏡下觀察細胞形態。每張爬片選取5 個染色良好視野，計數每個視野中的凋亡細胞，取5 個視野的均數為凋亡細胞數。

1.7 細胞中Bax 與Bcl-2 mRNA 及蛋白表達的檢測 采用RT-PCR 法檢測細胞中Bax 與Bcl-2 mRNA，PCR 產物經凝膠電泳，于凝膠成像系統中采集圖像，以目的基因與內參基因條帶積分光密度值的比值表示目的基因mRNA 的表達水平。采用Western blot 法檢測Bax、Bcl-2 蛋白，兔抗人Bcl-2 和Bax一抗稀釋50 倍，HRP 標記的羊抗兔二抗稀釋200倍，ECL 發光試劑盒顯像，用圖像分析系統分析，以目的蛋白與內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.8 統計學處理 采用SPSS 16.0 處理數據，組間凋亡細胞數、相應基因mRNA 和蛋白表達水平的比較用采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 6組細胞凋亡檢測結果 見表1。

表1 6組凋亡細胞數的比較

2.2 6組細胞中Bcl-2、Bax mRNA 表達的比較見圖1、表2。

圖1 RT-PCR 法檢測6組細胞中Bax(上圖)和Bcl-2(下圖)mRNA 的表達

表2 6組細胞中Bcl-2、Bax mRNA 表達的比較

2.3 6組細胞中Bcl-2、Bax 蛋白表達的比較 見圖2、表3。

圖2 Western-blot 法檢測6組細胞中Bcl-2(上圖)和Bax(下圖)蛋白的表達

表3 6組細胞中Bcl-2、Bax 蛋白表達的比較

3 討論

研究［2-3］認為，UVA 誘導細胞凋亡是一個綜合性生化反應過程。研究［10］發現，Bcl-2 基因家族與細胞凋亡的調控密切相關，其在線粒體通路中具有放大死亡受體通路信號的作用;Bcl-2 高表達可抑制凋亡，而促凋亡蛋白Bax 等可使線粒體膜通透性增加，引發細胞凋亡線粒體途徑開啟。生理狀態下Bcl-2 和Bax 形成動態平衡。UVA 輻射可使細胞色素C 在凋亡早期從線粒體中釋放進入胞質，進而下調Bcl-2 的表達，并上調Bax 的表達，導致細胞凋亡的發生［11-12］。

該研究中，作者觀察到，UVA 模型組細胞凋亡明顯增強，Bcl-2 mRNA 和蛋白表達降低，而Bax mRNA 和蛋白表達明顯升高，說明UVA 照射激活了人成纖維細胞HSF 的凋亡通路;而Gyp 含藥血清干預后，經UVA 照射的HSF 細胞凋亡較未干預細胞明顯減弱，Bcl-2 mRNA 和蛋白表達升高，而Bax mRNA 和蛋白表達明顯降低，且高劑量Gyp組效果更顯著。該研究結果說明Gyp 可通過上調凋亡抑制基因Bcl-2、下調凋亡促進基因Bax 的表達，緩解二者之間的失衡狀態，抑制細胞凋亡線粒體通路的活化，最終減少了光老化細胞的凋亡。

綜上所述，Gyp 可以逆轉UVA 誘導的人皮膚成纖維細胞的凋亡;其作用機制可能是上調抗凋亡基因Bcl-2 和下調促凋亡基因Bax 的表達，緩解Bcl-2和Bax 表達之間的失衡狀態，從而抑制了凋亡線粒體信號通路活性。

［1］Leccia MT，Richard MJ，Favier A，et al.Zinc protects against ultraviolet A1-induced DNA damage and apoptosis in cultured human fibroblasts［J］.Biol Trace Elem Res，1999，69(3):177

［2］Xie H，Liu F，Liu L，et al.Protective role of AQP3 in UVAinduced NHSFs apoptosis via Bcl2 up-regulation［J］.Arch Dermatol Res，2013，305(5):397

［3］Lamore SD，Wondrak GT.UVA causes dual inactivation of cathepsin B and L underlying lysosomal dysfunction in human dermal fibroblasts［J］.J Photochem Photobiol B，2013，123:1

［4］王大偉，吳景東.絞股藍抗小鼠皮膚衰老的實驗研究［J］.四川中醫，2008，26(10):17

［5］金曉哲，吳景東，閆?；?外用中藥絞股藍對紫外線照射無毛小鼠皮膚組織影響的實驗研究［J］.中國生物美容，2009(4):16

［6］王彩霞，王麗新.外用絞股藍對自然衰老小鼠皮膚組織中CAT 活性、MDA 含量影響的實驗研究［J］.實用中醫內科雜志，2011，25(7):29

［7］李楠，谷繼卜，曲桂霞.絞股藍水煎劑對老齡小鼠SOD 和LPO 的抗衰老研究［J］.黑龍江醫藥科學，2012，35 (4):41

［8］陶冶，張小卿，吳瓊，等.絞股藍總皂苷含藥血清對光老化HaCaT 細胞中p38MAPK 蛋白和c-Jun mRNA 表達的抑制作用［J］.吉林大學學報:醫學版，2012，47(10):1178

［9］李薇.長波紫外線對人角質形成細胞和成纖維細胞的形態、數目及誘導型一氧化氮合酶表達的影響［D］.長沙:中南大學，2007.

［10］Pimentel AA，Benaim G.Ca2+and sphingolipids as modulators for apoptosis and cancer［J］.Invest Clin，2012，53(1):84

［11］閆言，王寶璽.紫外線引起氧化應激與細胞凋亡機制研究進展［J］.國外醫學:皮膚性病學分冊，2004，30(3):167

［12］Murphy M，Mabruk MJ，Lenane P，et al.The expression of p53，p21，Bax and induction of apoptosis in normal volunteers in response to different doses of ultraviolet radiation［J］.Br J Dermatol，2002，147(1):110