不同劑量銀杏葉提取物對紅藻氨酸致癇大鼠神經肽Y蛋白表達的影響*

王 芳，俸軍林 ，張小芬，蔣靜子，吳 嵐，梁 靜，陳春蓮，易玉芳

1)桂林醫學院附屬醫院神經內科 桂林541001 2)桂林醫學院附屬醫院老年科 桂林541001

#通訊作者，男，1965年6月生，碩士，主任醫師，研究方向:癲癇與腦血管病，E－mail:2274196104@qq.com

癲癇是由各種原因引起的腦細胞異常放電導致的腦功能障礙綜合征，雖然80%左右患者的癲癇發作能被現代抗癲癇藥控制，但仍有約20%的患者反復發作，且大部分患者需長期甚至終生服藥治療，尋找更安全、高效的療法和方藥具有很重要的臨床意義。銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract，GBE)是從銀杏葉中利用醇溶液提取出的混合成分，它除了對心血管系統具有明顯的藥理作用外，對減少神經細胞損傷、增加神經遞質的含量、改善腦細胞功能、促進腦功能恢復等也具有很好的藥理作用，可作為抗癲癇的輔助藥物［1］。神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)是一種抑制性神經遞質，研究［2］顯示其具有抑制局部和全身性癲癇發作的作用。該研究通過于側腦室注射紅藻氨酸(kainic acid，KA)建立癲癇模型，觀察不同劑量GBE 急性期給藥對癲癇的干預效應及其對NPY 蛋白表達的影響，以探討GBE 的抗癲癇機制，為開發出高效、廣譜、低毒的抗癲癇藥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 KA 注射液購自美國Sigma公司，銀杏葉提取物761(GBE761)購自西安天本生物工程有限公司，兔抗大鼠NPY 蛋白多克隆抗體購自Bioworld Technology 公司，日本產Narishige SR－6R型大鼠腦立體定向儀、電子顯微鏡等。

1.2 動物分組及給藥方法 雄性SD 大鼠90 只，體重250～300 g，由桂林醫學院實驗動物中心提供。所有實驗動物均在溫暖(20℃)、避強光、避噪音、自由進食及飲水條件下單籠飼養。大鼠經適應性喂養3 d 后采用隨機數字表法分為以下幾組:假手術組(n=18);GBE 對照組(n =18)，用同體積的體積分數50% 1，2－丙二醇代替GBE;癲癇模型組(n =18);小劑量GBE組(n =18)，于制備癲癇模型0.5 h 后按100 mg/kg 腹腔注射溶于體積分數50%的1，2－丙二醇的質量分數1%的GBE761 注射液;大劑量GBE組(n=18)，于制備癲癇模型后0.5 h 按200 mg/kg 腹腔注射質量分數1%的GBE761 注射液。根據致癇后處死時間不同，各組再分為造模成功后6、12 及24 h 3 個亞組(n=6)。

1.3 癲癇模型制作 采用腹腔注射體積分數10%水合氯醛(0.036 mL/kg)麻醉，將大鼠頭部固定于立體定向儀上，剪除其頭部的毛發，局部消毒;術者戴無菌手套，沿頭部正中線切開頭皮10～15 mm，接著用體積分數30%的雙氧水腐蝕顱骨上腱膜及顱骨外膜，暴露前囟。依照大鼠腦立體定向圖譜定位右側側腦室，鉆一直徑為1.0 mm 的圓孔，深達硬腦膜表面。將預先裝有KA 的微量進樣器沿鉆孔進針，進針深度達4.5 mm 時向側腦室內注射0.8 g/L KA 溶液1 μL，在10 min 內緩慢勻速地注射完畢，留針5 min 后緩慢拔針。最后用骨蠟封閉顱骨所鉆孔，縫合頭皮，放回籠中進行行為學觀察。假手術組不注射KA。

1.4 大鼠行為學觀察 將大鼠癲癇發作級別分為6 級。0 級:正常;Ⅰ級:立須、咀嚼等面肌抽動;Ⅱ級:點頭等頸肌抽動;Ⅲ級:一側前肢的抽動、陣攣;Ⅳ級:雙側前肢的抽動、陣攣，伴站立;Ⅴ級:四肢強直、抽動，伴站立、跌倒及身體強直背曲。觀察各組大鼠的行為2 h 并記錄癲癇發作級別，Ⅲ級及以下為輕型發作，Ⅳ～V 級為重型發作。Ⅳ～V 級視為癲癇造模成功，如果造模失敗，則以相同數量動物補充造模。

1.5 灌注取材及標本制備 先將大鼠麻醉，再剪開大鼠胸腔暴露心臟，將針頭從大鼠心尖刺入，同時剪開右心耳放血。接著向心臟內快速推注生理鹽水約200 mL，使從右心耳流出的液體最終清亮，肺臟變白。然后向心臟內快速灌注40 g/L 多聚甲醛約400 mL，使四肢及頭尾變硬。注射完畢即刻斷頭取腦，于40 g/L 多聚甲醛中固定24 h。取前囟后2.5～4.5 mm 處腦組織，脫水包埋制成蠟塊，用于HE 染色及免疫組化染色。

1.6 海馬組織HE 染色 切取石蠟切片，厚約3 μm，進行HE 染色，置于顯微鏡下觀察神經細胞形態學變化。

1.7 海馬組織NPY 蛋白免疫組化染色 切取石蠟切片，厚約4 μm，進行免疫組化染色，取海馬齒狀回門區組織觀察NPY 蛋白，陽性細胞胞質呈棕黃色。光學顯微鏡下觀察5 個高倍(×400)視野，計數陽性細胞數，取其均值作為NPY 蛋白表達量。

1.8 統計學處理 采用SPSS 17.0 進行數據分析。5組間以及3 個時間點間海馬組織NPY 蛋白表達量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK－q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 行為學觀察結果 見表1。假手術組無癇樣發作，GBE 對照組和癲癇模型組均為Ⅳ～Ⅴ級發作，小劑量GBE組與大劑量GBE組均為Ⅱ～Ⅳ級發作。

表1 各組大鼠行為學觀察結果例

2.2 海馬組織HE 染色結果 在KA 注射后6 h 即可見癲癇模型組注射側海馬各區神經元受到損害，正常細胞明顯減少，神經元發生變性、壞死，尤以海馬CA3 區最明顯。變性的神經元細胞腫脹，細胞排列不整齊、輪廓不清、間隙增大，核仁模糊，胞核移位。壞死的神經元胞質濃縮、深染，核碎裂;星形膠質細胞體積增大，胞質淡染;齒狀回顆粒細胞部分受損，細胞排列雜亂，胞核固縮。于KA 注射后12 h 神經元變性、壞死更明顯。KA 注射后24 h，CA3 區錐體細胞脫失，細胞排列稀疏、層次減少;小劑量GBE組與大劑量GBE組CA3 區神經元損害均較癲癇模型組減輕;GBE 對照組CA3 區神經元損害程度與癲癇模型組相同。見圖1。

圖1 各組大鼠KA 注射后24 h 右側海馬CA3 區HE 染色(1)和齒狀回區NPY 蛋白免疫組化染色(2)結果(×400)

2.3 海馬組織免疫組化染色結果 見圖1、表2。

表2 各組大鼠右側海馬齒狀回區NPY 蛋白表達量比較

3 討論

GBE 所含成分銀杏總黃酮苷和銀杏苦內酯等具有擴張腦血管、促進腦血液循環、增加腦血流量等作用，可改善缺氧腦細胞的能量代謝和營養，提高腦細胞耐缺氧能力，減輕腦水腫，減少神經細胞損傷，增加神經遞質的含量，改善腦細胞功能，促進腦細胞的恢復［1－3］。該實驗中KA 模型有與人類顳葉癲癇極為相似的海馬硬化神經病理形態學改變及癲癇發作行為特征［4－5］，結果顯示，GBE 對照組和癲癇模型組均為Ⅳ～Ⅴ級發作，小劑量及大劑量GBE組均為Ⅱ～Ⅳ級發作。結果表明GBE 對致癇大鼠具有一定抗癲癇作用，GBE 急性期給藥能減少致癇大鼠神經元損害并減輕其癲癇發作程度，但2 種劑量GBE的效果差異無統計學意義。

NPY 是一種含36 個氨基酸的神經肽，大腦皮層、海馬、丘腦及下丘腦為其主要分布區。NPY 具有多方面的生物學作用［6］。另外，在神經元興奮性尤其是在中間神經元的釋放方面，NPY 也發揮著極其重要的作用［7］。此外，還有研究［8］顯示，癲癇的短暫發作誘導的NPY 持續過度表達在預防癲癇方面有重要作用。海馬旁區域的可塑性及NPY 過度表達可被癲癇的反復發作持久激活［9］。癲癇發作后腦組織內NPY 表達增多是機體抑制癲癇發作的代償機制，同時也是機體自我保護機制的表現［10－12］。該實驗中，同一處死時間點各組大鼠相比較，癲癇模型組海馬中NPY 蛋白表達量較假手術組明顯增多，同組內3 個時間點NPY 蛋白表達量呈上升趨勢，進一步驗證了上述理論。該實驗中，小劑量GBE組和大劑量GBE組NPY 蛋白的表達量均高于癲癇模型組，由此推測GBE 的抗癲癇作用很可能是通過上調NPY 的表達進一步激發NPY 的抑制癲癇作用來實現。

綜上所述，2 種劑量GBE 急性期給藥均可使大鼠癲癇發作級別降低，神經元損害減輕，NPY 蛋白表達增多，提示GBE 急性期給藥有一定的抗癲癇作用。GBE 的抗癲癇機制與減輕神經元的損害、降低癲癇發作程度、上調NPY 蛋白的表達有關，這種作用機制有可能是抗癲癇治療的一種新思路。

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