牙齦卟啉單胞菌促進動脈粥樣硬化的機制研究

潘盛波，雷 浪，李厚軒，閆福華

2.南京大學醫(yī)學院 附屬口腔醫(yī)院，南京 210008

牙周感染與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）密切相關。流行病學研究和動物實驗均顯示，牙周感染能夠加速AS的形成[1－2]。牙周炎進展過程中，細菌及其代謝產(chǎn)物可以進入血液，形成低水平的菌血癥和內(nèi)毒素血癥。在血管壁中，宿主防御系統(tǒng)可能利用 Toll樣受體（toll like receptors，TLRs）等模式識別受體，識別侵入的牙周致病菌及其代謝產(chǎn)物，激活多種促炎轉(zhuǎn)錄因子的激活，產(chǎn)生先天免疫反應，導致組織局部炎癥反應發(fā)生[3]。目前，AS被認為是一種炎癥性疾病，AS血管局部腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factorα，TNF－α）、單核細胞趨化蛋白－1（monocyte chemotactic protein－1，MCP－1）、白細胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）等炎癥因子表達上調(diào)，血管局部表現(xiàn)為炎癥反應[4－5]。牙齦卟啉 單 胞 菌 （Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis）能夠刺激主動脈內(nèi)皮細胞、臍靜脈內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞以及巨噬細胞促炎細胞因子的表達[6]。載脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E－deficient，ApoE－／－）小鼠由于脂質(zhì)代謝障礙，在普通飲食下即可形成高脂血癥，是建立AS理想的動物模型[7]。本研究擬進一步分析TLR通路在P.gingivalis菌血癥促進ApoE－／－小鼠AS進展過程中的作用，進一步揭示牙周病和心血管疾病間的相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料P.gingivalis33277（美國 ATCC公司）；腦心浸出液（brain heart infusion，BHI）、酵母提取物（英國Oxoid公司）；蘇丹Ⅳ染料（美國Sigma公司）；TNF－α、MCP－1和IL－1β酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（美國eBioscience公司）；TNF－α和 MCP－1多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；免疫組織化學試劑盒（中國邁新生物技術開發(fā)有限公司）；核因子－κB（nuclear factor－κB，NF－κB）、TLR－2、TLR－4 和GAPDH多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、HRP標記二抗、ECL化學發(fā)光試劑盒（中國碧云天生物技術有限公司）；脫脂奶粉（美國BD公司）；凝膠電泳遷移率實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）試劑盒、細胞核和細胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、生物素3′末端DNA標記試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)P.gingivalis在含 37g／L BHI、5g／L 酵 母 提 取 物、5mg／L 氯 化 血 紅 素 和0.2mg／L甲萘醌的培養(yǎng)基中厭氧條件下培養(yǎng)。

1.2.2 動物飼養(yǎng) 6周齡 ApoE－／－小鼠（18只）[北京大學醫(yī)學部動物中心，許可證號SCXK（京）2011－0012]，在無特異致病菌、恒溫、恒濕、12h光照和12h黑暗以普通飼料飼養(yǎng)4周。至10周齡時，分為對照組（9只）和P.gingivalis感染組（9只）。對照組尾靜脈注射50μL的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）；P.gingivalis感染組尾靜脈注射50μL含107個P.gingivalis細菌的PBS，每周1次，共10周。

1.2.3 標本收集 注射細菌第10周時，接種P.gingivalis后24h，小鼠禁食過夜，異氟烷吸入麻醉，眶后靜脈取血后，實施安樂死，解剖分離主動脈樹（從主動脈近心端到髂動脈），其中3只的主動脈樹用于主動脈樹蘇丹Ⅳ染色，其他6只的主動脈樹分3段分別用于免疫組織化學、免疫印跡、凝膠電泳遷移率實驗檢測。

1.2.4 主動脈樹蘇丹Ⅳ染色 小鼠主動脈樹縱向剖開，固定于橡膠板上，4%的多聚甲醛固定24h，70%乙醇漂洗5min，0.5%蘇丹Ⅳ（由35%乙醇和50%丙酮混合液配制）染色6min，80%乙醇脫染5min。數(shù)碼相機拍照，采用Image－Pro plus 6.0軟件測量分析。

1.2.5 血清炎癥因子檢測 血液標本肝素抗凝，4℃、3 000r／min離心5min，收集上層血漿。按照ELISA試劑盒說明書的實驗操作步驟測定血液中TNF－α、MCP－1和IL－1β水平。

1.2.6 免疫組織化學染色 主動脈近心端1cm組織經(jīng)固定、脫水、浸蠟和包埋制作石蠟切片，5μm連續(xù)切片后，脫蠟、水化和抗原修復，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，非免疫性動物血清封閉非特異性抗原，一抗TNF－α（1∶50）和 MCP－1（1∶50）4℃孵育過夜，加生物素化的二抗孵育，加SAB－HRP復合物，DAB顯色，蘇木精復染，最后脫水、透明、封片并拍照，圖片采用Image－Pro plus 6.0軟件分析。

1.2.7 免疫印跡檢測 RIPA裂解液主動脈組織抽提蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；聚丙烯酰胺凝膠電泳，每個上樣孔加40μg蛋白樣品，濃縮膠80V電泳20min，分離膠120V電泳60min；將電泳分離后的蛋白濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜到NC膜上；轉(zhuǎn)膜后，以5%脫脂奶粉封閉NC膜，加一抗TLR－2（1∶1000）、TLR－4（1∶1 000）和 GAPDH（1∶1 500）4℃ 孵育過夜，加 HRP標記的二抗37℃孵育1h，用ECL化學發(fā)光法顯色，最后掃描分析條帶。

1.2.8 凝膠電泳遷移率檢測 抽提主動脈組織核蛋白并測定濃度；用生物素3′末端DNA標記試劑盒將DNA探針標記上生物素；樣品制備：樣品體系包括DNA探針、待測核蛋白、NF－κB抗體、反應體系和上樣緩沖液的混合液；將樣品混合液加到上樣孔里，進行非變性膠電泳；電泳后用濕轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜后用紫外交聯(lián)儀進行交聯(lián)；交聯(lián)后的膜在封閉液中封閉后，加辣根過氧化物酶標記的鏈親和素孵育，后加ECL化學發(fā)光試劑進行顯色，掃描分析條帶。

2 結 果

2.1 斑塊面積變化 ApoE－／－小鼠主動脈樹蘇丹Ⅳ染色顯示，P.gingivalis感染組斑塊面積較對照組增加；量化分析顯示，P.gingivalis感染組斑塊面積百分比為（37.2±1.97）%，高于對照組（23.1±2.23）%（P＜0.05，圖1）。

圖1 主動脈粥樣斑塊形成Fig 1 Atherosclerotic plaque in aortic tree

2.2 血清炎癥因子水平的變化 ELISA法檢測血漿標本炎癥因子水平，結果顯示：P.gingivalis感染組 TNF－α水平為（348.09±17.97）pg／mL，顯著高于對照組（202.46±16.62）pg／mL；P.gingivalis感染組 MCP－1水平為（755.34±41.53）pg／mL，明顯高于對照組（510.99±15.87）pg／mL；P.gingivalis感染組IL－1β水平為（126.65±27.45）pg／mL，顯著高于對照組（59.95±13.70）pg／mL（P＜0.05）（圖2）。

2.3 ApoE－／－小鼠主動脈組織炎癥因子水平 免疫組織化學染色主動脈組織切片顯示：P.gingivalis感染組主動脈血管壁TNF－α和 MCP－1均較對照組表達增加（圖3）。

圖2 血液炎癥因子水平Fig 2 Proinflammatory cytokines in blood

圖3 主動脈組織炎癥因子水平Fig 3 Expression of inflammatory cytokines in vascularwall

2.4 ApoE－／－小鼠主動脈組織 TLR－2、TLR－4蛋白表達水平和NF－κB活化水平 免疫印跡法檢測顯示：P.gingivalis感染組主動脈組織中TLR－2、TLR－4蛋白表達顯著高于對照組（P＜0.05，圖4A）。EMSA檢測主動脈組織中NF－κB的活化水平，結果顯示：P.gingivalis感染組明顯高于對照組（P＜0.05，圖4B）。

3 討 論

牙周感染與心血管疾病密切相關，能加速AS的形成。ApoE－／－小鼠靜脈注射P.gingivalis后，主動脈AS的形成加速[8]；同樣，高脂血癥小鼠口腔接種P.gingivalis后 ，無名動脈AS的形成加速[9]，提示牙周炎和牙周炎形成的菌血癥均會促進AS進展加速。然而，前述研究未深入研究牙周致病菌促進AS的機制。本結果顯示，牙周致病菌通過TLRs／NF－κB通路，促進全身的炎癥反應，并且加重血管組織中的炎癥反應，從而加速ApoE－／－小鼠AS的形成。

圖4 主動脈組織TLR－2和TLR－4蛋白表達水平和NF－κB活化水平Fig 4 Protein expression of TLR－2、TLR－4and NF－κB activity in in aortic tissues

在炎癥發(fā)生和進展過程中，TNF－α、MCP－1和IL－1β等促炎細胞因子能夠活化和趨化免疫細胞，參與炎癥反應。在人和動物的動脈粥樣斑塊中，均可觀察到這些炎癥細胞因子表達的上調(diào)，說明其參與 AS形成[10－11]。本實驗觀察到，P.gingivalis感染組血液中 TNF－α、MCP－1和IL－1β水平較對照組增加，主動脈組織中TNF－α和 MCP－1表達上調(diào)。炎癥因子促進AS形成的可能機制是 MCP－1能趨化血液中的單核細胞向血管壁遷移，并轉(zhuǎn)入內(nèi)膜下分化為巨噬細胞；TNF－α和IL－1β能夠活化內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和血管平滑肌細胞，進一步加重炎癥反應和 AS的形成[12]。

TLRs是一組病原體相關分子型識別受體，能識別細菌、病毒和寄生蟲等外界微生物的細胞壁、細胞膜或者纖毛等的保守序列，即病原體相關性分子型（pathogen associated molecule patterns，PAMPs），在微生物感染反應的固有免疫信號轉(zhuǎn)導中起重要作用。在肺炎支原體促進AS的研究中，發(fā)現(xiàn)血管壁TLRs表達上調(diào)[13]。本實驗結果進一步顯示，P.gingivalis感染組主動脈組織中 TLR－2和TLR－4蛋白表達增加，這與Gibson等的結果一致[14]；Liu等報道 TLR－2－／－ApoE－／－小鼠 AS明顯減少[15]。因此，推測P.gingivalis感染激活TLR－2和TLR－4的表達，通過級聯(lián)信號傳導，激活下游轉(zhuǎn)錄因子，激活細胞核內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄，引發(fā)機體固有免疫炎癥反應，活化免疫細胞，加重AS。

NF－κB是主要的炎癥反應的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控許多細胞因子、趨化因子、黏附分子、急性反應蛋白、生長因子等的表達。在人類AS病損的內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞中均能檢測到活化的NF－κB[16]，NF－κB參與 AS形成的各個階段。本實驗觀察到，P.gingivalis感染組主動脈組織中NF－κB活性增加，其可能機制是P.gingivalis依賴TLRs途徑，介導NF－κB的活化。

本實驗發(fā)現(xiàn)，血管壁的內(nèi)皮細胞、單核細胞和中性粒細胞等防御系統(tǒng)的成分利用P.gingivalis感染，通過TLR識別血液中的牙周致病菌P.gingivalis，激活將信號轉(zhuǎn)導給NF－κB，使轉(zhuǎn)錄因子p65亞單位進入細胞核內(nèi)，與炎癥細胞因子基因中的轉(zhuǎn)錄序列結合，啟動多種炎癥細胞因子的表達。各種炎癥因子發(fā)揮相應的生物學效應，活化、趨化免疫細胞，促進血管局部和全身的免疫炎癥反應，加速AS形成。

[1]Lockhart P B，Bolger A F，Papapanou P N，etal.Periodontal disease and atherosclerotic vascular disease：does the evidence support an independent association？a scientific statement from the American Heart Association[J].Circulation，2012，125（20）：2520－2544.

[2]Teles R，Wang C Y.Mechanisms involved in the association between periodontal diseases and cardiovascular disease[J].OralDis，2011，17（5）：450－461.

[3]Hayashi C，Gudino C V，Gibson F C 3rd，etal.Review：Pathogen－induced inflammation at sites distant from oral infection：bacterial persistence and induction of cell－specific innate immune inflammatory pathways[J].MolOralMicrobiol，2010，25（5）：305－316.

[4]Libby P.Inflammation and cardiovascular disease mechanisms[J].AmJClinNutr，2006，83（2）：456－460.

[5]Libby P.Inflammation in atherosclerosis[J].Arterioscler ThrombVascBiol，2012，32（9）：2045－2051.

[6]Gibson F C 3rd，Yumoto H，Takahashi Y，etal.Innate immune signaling and Porphyromonas gingivalis－accelerated atherosclerosis[J].JDentRes，2006，85（2）：106－121.

[7]Massaro D，Massaro G D.Apoetm1Unc mice have impaired alveologenesis，low lung function，and rapid loss of lung function[J].AmJPhysiolLungCellMolPhysiol，2008，294（5）：991－997.

[8]Li L，Messas E，Batista E L Jr，etal.Porphyromonas gingivalis infection accelerates the progression of atherosclerosis in a heterozygous apolipoprotein E－deficient murine model[J].Circulation，2002，105（7）：861－867.

[9]Hayashi C，Viereck J，Hua N，etal.Porphyromonas gingivalis accelerates inflammatory atherosclerosis in the innominate artery of ApoE deficient mice[J].Atherosclerosis，2011，215（1）：52－59.

[10]Libby P，Ridker P M，Hansson G K.Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis[J].Nature，2011，473（7347）：317－325.

[11]Ma S，Guo J，You X，etal.Expressions of interleukin－1beta and interleukin－6within aortas and uteri of rats with various severities of ligature－induced periodontitis[J].Inflammation，2011，34（4）：260－268.

[12]Packard R R，Lichtman A H，Libby P.Innate and adaptive immunity in atherosclerosis[J].SeminImmunopathol，2009，31（1）：5－22.

[13]Moghimpour B F，Vallejo J G，Rezaei N.Toll－like receptor signaling pathways in cardiovascular diseases：challenges and opportunities[J].IntRevImmunol，2012，31（5）：379－395.

[14]Gibson F C 3rd，Hong C，Chou H H，etal.Innate immune recognition of invasive bacteria accelerates atherosclerosis in apolipoprotein E－deficient mice[J].Circulation，2004，109（22）：2801－2806.

[15]Liu X，Ukai T，Yumoto H，etal.Toll－like receptor 2plays a critical role in the progression of atherosclerosis that is independent of dietary lipids[J].Atherosclerosis，2008，196（1）：146－154.

[16]de Winther M P，Kanters E，Kraal G，etal.Nuclear factor kappaB signaling in atherogenesis[J].ArteriosclerThromb VascBiol，2005，25（5）：904－914.