福建地區口腔癌患者p53基因72密碼子多態性與口腔癌易感性的研究

何保昌，陳 法，劉芳萍，柳迪萌，陳 珍，蔡 琳

吸煙、飲酒是口腔癌的主要危險因素，但暴露于同樣環境因素中的人發生口腔癌的僅是一部分，這提示遺傳因素所決定的個體易感性在口腔癌演變過程中扮演著不可忽視的角色。Jing等在中國漢族人群中研究發現，p53第4外顯子72密碼子多態性與口腔癌有關，特別是攜帶Pro等位基因可增加患口腔癌的風險[1]。但Saini和Jiang等的研究并未發現p53第4外顯子72密碼子多態性與口腔癌有關[2－3]。近年來，p53基因第4外顯子72密碼子多態性與口腔癌的關系也受到廣大學者的研究，但結論尚存在爭議。鑒于此，本研究探討p53基因第4外顯子72密碼子多態性與口腔癌易感性的關系，并分析其與環境因素在口腔癌發生中的交互作用，力求更全面地探討p53基因多態性、環境因素與口腔癌的關聯，為口腔癌的預防和控制提供分子水平的依據，以提高口腔癌的三級預防水平。

1 對象與方法

1.1 對象 采用病例對照研究設計，病例組149例，為2010年9月－2014年1月在福建醫科大學附屬第一醫院口腔頜面外科住院并經病理確診的口腔癌新發病例；對照組303例，為同期進行健康體檢的人群、其他科室的住院患者以及社區人群。病例組與對照組一般人口學特征的比較分析見表1。2組在性別、年齡、民族、婚姻狀況方面均衡可比（P＞0.05），但在職業、文化程度、居住地等方面的分布差別有統計學意義。與對照組比較，病例組吸煙、飲酒、不良修復體等所占比例較大，差別均有統計學意義（P＜0.05）；但在飲茶、腫瘤家族史方面差別無統計學意義（P＞0.05）。本研究經過福建醫科大學倫理委員會批準，研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 問卷調查及標本采集 采用統一編制的調查表，由經過統一培訓的調查員進行面對面調查獲得研究對象的一般人口學特征、吸煙、飲酒以及飲茶等相關信息。飲酒指每周至少1次，持續半年以上者[4]；吸煙定義為累計吸煙100支以上者[5]；飲茶定義為每周至少1杯，持續半年以上[6]。病例對照人群采集抗凝血樣標本，離心分離出白細胞，用裂解法提取DNA，用于p53基因型檢測。

1.3 基因檢測 引物序列由國際癌癥中心（IARC）提供，上海生工公司合成。

擴增目的片段413bp。PCR反應體系總量50μL，包括PCRmix 14.5μL、上下游引物各2.0μL、模板DNA 2.0μL，滅菌水加至50μL。擴增參數：94℃預變性2min→94℃變性30s→60℃退火45s→72℃延伸120s，于PCR儀（480，美國PE公司）循環50次，72℃延伸10min。酶切反應體系總量25μL，PCR產物10μL、10×Buffer反應緩沖液2.5μL、Bst UI酶1.0μL，37℃消化過夜。酶切后產物點樣于2.0%瓊脂糖凝膠中（凝膠中含5mg／mL的溴化乙錠），100V電泳45min，電泳液為1×TAE。停止電泳后，在凝膠成像系統中觀察結果并照相，Pro／Pro型可在413bp處出現1條帶，Arg／Arg型可在253和160bp處出現2條帶，Pro／Arg型可在160、253和413bp處出現3條帶。

1.4 統計學處理 采用χ2檢驗對研究對象的一般人口學特征進行均衡性檢驗，運用Hardy－Weinberg遺傳平衡定律判斷對照群體代表性；采用非條件Logistic回歸模型計算SNP位點與口腔癌關系的比值比（odds ratio，OR）、95%可信區間（95%confidence interval，95%CI）及其相乘交互作用。利用叉生分析和Rothman提出的超額相對危險度（RERI）、歸因比（AP）和交互作用指數（S）進行相加交互作用分析[7]。以上分析均由Stata 12.1軟件包完成，所有P值均為雙側檢驗結果，檢驗水準α為0.05。

表1 病例組與對照組的人口學特征比較Tab 1 The comparison of demographic data of cases and controls

2 結 果

2.1 p53基因第4外顯子72密碼子多態性檢測結果 先對p53基因第4外顯子進行PCR擴增，擴增產物陽性的再做限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP），在413bp處擴增出目的片段，PCR擴增結果見圖1。p53基因第4外顯子經內切酶Bst UI酶消化后，進行瓊脂糖凝膠電泳，呈現3種不同的電泳條帶（即3種不同的基因型），酶切結果見圖2。純合子Pro／Pro基因型因基因突變使酶切位點丟失，在413bp處出現1條帶，野生型純合子Arg／Arg基因型可在253和160bp處出現2條帶，雜合子Pro／Arg基因型在160、253和413bp出現3個片段。

圖1 p53基因第4外顯子PCR結果Fig 1 The result of p53gene exon4PCR

圖2 p53基因第4外顯子72密碼子多態性酶切結果Fig 2 The result of p53gene polymorphism restriction map on exon4condon 72

2.2 Hardy－Weinberg平衡檢驗及基因位點遺傳模型分析 p53基因第4外顯子72密碼子在病例組和對照組中的基因型頻率分布進行Hardy－Weinberg遺傳平衡度檢驗（表2），結果顯示各基因型的分布頻率符合 Hardy－Weinberg遺傳平衡（P＞0.05），說明對照人群具有代表性。

表2 p53基因72密碼子多態性的Hardy－Weinberg檢驗結果Tab 2 The result of p53gene codon 72polymorphism Hardy－Weinberg test

2.3 p53基因72密碼子多態性與口腔癌易感性的研究 與對照組相比，病例組p53基因攜帶Pro／Pro基因型是發生口腔癌的遺傳易感因素；經性別、年齡、職業、民族、教育程度、體質量指數、居住地、婚姻狀況、腫瘤家族史調整后，結果仍然一致，與Arg／Arg基因型及 Arg／Arg＋Arg／Pro基因型相比，p53基因攜帶Pro／Pro基因型的OR值分別為1.837（1.016，3.325）、2.189（1.389，3.449）。結果見表3。

表3 p53基因72密碼子多態性與口腔癌易感性的研究Tab 3 Study on the susceptibility of p53gene codon 72polymorphism and oral cancer

2.4 p53基因72密碼子多態性與環境因素的交互作用 與攜帶Arg／Arg＋Arg／Pro基因型的未吸煙者相比，攜帶Pro／Pro基因型的未吸煙者和吸煙者患口腔癌的風險均顯著增加，其OR值及95%CI分別為 2.286（1.352，3.865）和 7.672（3.567，16.503）。但并未發現p53基因攜帶Pro等位基因與吸煙存在相乘及相加交互作用。

與攜帶Arg／Arg＋Arg／Pro基因型的未飲酒者相比，攜帶Pro／Pro基因型的飲酒者患口腔癌風險增 加 更 為 顯 著 （OR：11.406，95%CI：4.740，27.444）。而且p53基因攜帶Pro等位基因與飲酒之間存在顯著的相乘交互作用（OR相乘：4.375，95%CI：1.646，11.627），但并未發現它們之間存在相加交互作用。

與攜帶Arg／Arg＋Arg／Pro基因型的未飲茶者相比，攜帶Pro／Pro基因型的飲茶者患口腔癌風險增加3.108倍（1.587，5.739），但并未發現p53基因攜帶Pro等位基因與飲茶之間存在顯著的相乘及相加交互作用（表4）。

3 討 論

3.1 Hardy－Weinberg遺傳平衡 目前認為在分析基因多態性與疾病的關聯時，要求對照基因型需符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律，用以說明研究的人群選擇來自隨機婚配的群體，且樣本量足夠大。本次研究對照人群的p53基因第4外顯子72密碼子的多態性基因位點符合Hardy－Weinberg遺傳平衡，可以認為本次研究對照人群具有人群代表性。

3.2 p53基因第4外顯子72密碼子的多態性與口腔癌易感性的關系 在腫瘤發生過程中，抑癌基因的失活和變異起著重要的作用。p53基因作為與人類腫瘤關系最為密切的抑癌基因而受到廣泛關注，其定位于人類染色體17p13.1，有11個外顯子和10個內含子。p53基因第4外顯子72密碼子由于使G顛換成C而產生2個不同的等位基因Arg和Pro，這種p53基因72密碼子多態性會引起p53基因編碼蛋白功能發生改變，而P53蛋白是重要腫瘤抑制劑，發揮著基因衛士的功能，主要參與啟動細胞周期監控、觸發細胞凋亡、促進受損的DNA修復。因此P53蛋白的功能發生改變后，便會引起機體對一些腫瘤的基因易感性[8－9]。

有實驗表明，p53第4外顯子72密碼子2種基因編碼的P53Pro蛋白和P53Arg蛋白均為野生型，但兩者的生物學功能則不完全相同，主要表現在轉錄激活作用、抑制轉化細胞生長和誘導細胞凋亡能力等方面[10]。生物學功能的差異可能是P53Arg和P53Pro通過不同途徑選擇性地調節細胞特定功能的結果。

p53第4外顯子72密碼子多態性的Arg／Arg、Pro／Arg、Pro／Pro 3種基因型在病例組的分布頻率分別為20.13%、44.30%、35.57%，在對照組的分布頻率分別為23.10%、55.12%、21.78%，野生型Arg／Arg基因在2組分布頻率差別不大。與Arg／Arg基因型及 Arg／Arg＋Pro／Pro基因型相比，攜帶Pro／Pro基因型使口腔癌發病風險分別增加1.837倍和2.189倍，表明人群攜帶Pro／Pro基因型可能是口腔癌的危險因素，這與Jing等的研究結果一致[1]。原因可能是P53Pro對細胞凋亡的誘導作用及對細胞損傷的修復功能較P53Arg強所致，從而使機體在致癌因素的作用下易發生細胞的異常增生，導致腫瘤[11]。有研究發現，Pro／Pro通過Fas／FasL途徑調節頭頸部腫瘤的細胞凋亡[12]，因P53Arg型頭頸部鱗癌患者缺乏Fas和FasL的共表達，而且抗凋亡蛋白Bcl－2高表達，從而減弱P53Arg誘導細胞凋亡能力[13]。但Bau等研究發現，p53基因72密碼子的Arg／Arg基因與口腔癌的發生有關，與攜帶Pro／Pro基因型相比，攜帶Arg／Arg基因型可增加2.68倍患口腔癌的風險（1.19，6.01）[14]。Drummond等研究表明，p53第4外顯子72密碼子多態性與口腔癌無關[15]。研究結果不一致可能與p53基因多態性的分布受種族、地區、樣本量大小、研究對象的選擇、檢測方法等因素的影響，也可能受到其他混雜因素的干擾。p53第4外顯子72密碼子多態性與口腔癌易感性的關系有待進一步深入研究進行驗證。

3.3 p53第4外顯子72密碼子多態性與環境因素的交互作用 眾所周知，腫瘤的發生是遺傳因素和環境因素共同作用的結果。隨著現代科學技術的不斷發展，人們對腫瘤病因學研究已經從單純的危險因素分析過渡到揭示暴露因子與遺傳特征的聯合作用。隨著人們生活水平的提高，吸煙、飲酒、飲茶等生活習慣已經成為多數人日常生活中不可或缺的一部分，生活方式與基因多態性之間的交互作用值得關注。

本研究結果顯示，p53第4外顯子72密碼子多態性與飲酒之間存在相乘交互作用。攜帶Pro等位基因的飲酒者與攜帶Arg／Arg＋Arg／Pro基因的不飲酒者相比，口腔癌的風險提高11.406倍。這表明Pro基因型可調節飲酒的致癌作用，如果兩個因素同時暴露，使患口腔癌的危險性增加。本結果與Ihsan等研究結果一致[16]。飲酒是口腔癌重要危險因素之一，酒中可能包含一些致癌物質或產生一些致癌物，或可阻礙致癌物的降解，在致癌過程中，由于P53Pro等位基因的存在，使p53抑癌功能發生變化，細胞惡性生長，導致患口腔癌危險性升高。但本次研究未發現它們之間存在相加交互作用。

此外，P53Pro等位基因與吸煙之間的相乘交互作用雖然沒有統計學意義，但研究中發現，與攜帶Arg／Arg基因的不吸煙者相比，攜帶Pro／Pro基因型的吸煙者患口腔癌的OR值為7.672（3.567，16.503），提示P53Pro等位基因在一定程度上調節并增強吸煙的致癌作用。有研究顯示，重度吸煙者的口腔黏膜細胞DNA損傷明顯高于非吸煙者，頭頸部鱗癌患者p53基因過度表達和缺失與患者吸煙有關，煙草中的致癌物會誘發p53基因發生的突變和失活[17]。目前p53基因多態性與吸煙的交互作用在口腔癌中研究還很少，但p53多態性與吸煙的交互作用在其他癌癥研究中均有交互作用的報道，如p53基因型與肝癌的研究已有報道，攜帶Pro等位基因可提高乙肝病毒攜帶者患肝癌的危險性[18]；又如一些對肺癌的研究則表明，Pro等位基因可提高吸煙者患肺癌的危險性[19－20]；還有在前列腺癌的相關研究中也提示，Pro等位基因可提高吸煙者患癌的危險性[21]。因此，p53基因多態性所決定的遺傳易感性可調節在吸煙暴露下對不同癌癥發病的影響。P53Pro等位基因與吸煙聯合作用，在一定程度上可導致口腔癌發病風險增加。

綜上所述，p53基因Pro／Pro基因型可能是福建地區口腔癌的易感基因，飲酒與p53第4外顯子72密碼子多態性位點之間有相乘交互作用。遺傳因素無法改變，因此，提倡健康的生活方式對預防口腔癌有重要的意義。本次研究僅針對福建地區的人群，還需要擴大樣本量和地區范圍開展更深入的研究，進一步探討遺傳因素與生活方式在口腔癌發生發展中的相互作用。

（致謝：衷心感謝福建醫科大學附屬第一醫院口腔頜面外科林李嵩主任、林耿冰副主任醫師、饒振雄醫師、廖云陽醫師、鄭曉燕護士在現場流行病學調查中的大力支持，感謝福建醫科大學公共衛生學院黃江峰、葉珍妹、葉貴華、葉佳增在實驗過程中的辛勤付出。）

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