蛹蟲草多糖提取純化工藝研究

周國海 張 泳 趙力超 陳 奇 曹 庸

（1.泰州學院醫藥與化學化工學院，江蘇 泰州 225300；2.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

蛹蟲草（cordycepsmilitaris），又名北冬蟲夏草，與冬蟲夏草同屬不同種，同樣具有免疫調節、抗腫瘤、抗炎癥、降血糖等眾多功能［1，2］。天然的冬蟲夏草對生長環境要求苛刻，自然寄生率低，人工培養困難，因此價格昂貴。相比而言，蛹蟲草不僅分布廣泛，且人工培養技術成熟、成本低廉，已實現大規模生產，逐漸成為冬蟲夏草的理想替代品，具有很高的開發利用價值［3］。其中，蛹蟲草多糖是蛹蟲草中含量最高的藥理活性物質，將其提取出來作為原料開發成相應保健產品，比起直接進食蛹蟲草，前者不僅具有更高的消化吸收效率，而且能避免后者因達到功效所需而進食大量蛹蟲草的不足。因此如何提高蛹蟲草多糖的提取率、獲得更多更純的活性蛹蟲草多糖是對其進行開發利用的重要研究基礎。

目前多糖的提取方法主要有常規水提法、超聲波輔助提取法、酶解法和超臨界流體法等［4］。超聲波輔助提取法是利用空化產生的極大壓力使物料細胞壁破裂而促進胞內物質的溶出，雖有一定的助提作用，但在此過程中多糖的結構容易遭到破壞，而且在實際生產中設備的穩定性及安全性也難以保證［5］。酶解法是通過加入纖維素酶、果膠酶等裂解細胞壁使多糖更好地溶出，但酶試劑通常價格較貴限制了其工業應用。超臨界流體法是指以超臨界流體作為萃取劑，通過調節溫度和壓力改變流體的極性，從而改變目標產物的溶解度，實現選擇萃取與分離。該法缺點是所需設備和操作都在高壓下進行，要求及負荷較大，生產成本高，而且整個提取過程需要精密控制。顯然，以上幾種常用提取方法均存在較多不足，而且大部分都只停留在實驗室研究階段，尚未實現真正意義上的工業化生產。相比之下，常規水法提取使用的溶劑是水，廉價易得。多糖是由單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子多聚物，含有很多羥基，極性較大，易溶于水，因此該方法有較好的提取率。而且常規水提法對設備要求低，操作簡單，生產成本小，適合于多糖提取的工業化應用［6］。

水法提取的多糖中通常含有單糖、蛋白等雜質，在利用之前需要對其進行分離純化，在醇沉過程中通過調節多糖濃縮液濃度和乙醇濃度可去除單糖。剩下的主要雜質則是蛋白，常用的脫除方法包括Sevage法、酶法、等電點法和鹽析法［7］。Sevage法需要加入氯仿等有機溶劑，有一定毒性，容易造成多糖活性下降。而且該法需要重復操作多次，每次除去蛋白質的變性膠狀物時，部分多糖會隨著蛋白一起沉淀導致多糖損失嚴重。酶法需要加入蛋白酶試劑，價格昂貴，且通常需要針對不同蛋白質而聯用幾種酶制劑，成本較高，限制了其應用。等電點鹽析法是指利用鹽改變蛋白質在溶液中的離子強度，使其表面的大量電荷被中和，在等電點下分子凈電荷為零，分子之間容易發生碰撞、聚集而沉淀下來。該法具有操作簡單、成本低、對生物活性多糖具有穩定作用等優點，更適用于多糖的去蛋白純化［8］。

本試驗通過對蛹蟲草的重要活性物質蛹蟲草多糖進行水法提取和醇沉、去蛋白等純化工藝研究，優化蛹蟲草多糖的最佳制備工藝，希望能對更好地開發利用蛹蟲草提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草子實體粉末：無極限（中國）有限公司；

牛血清蛋白：美國Sigma公司；

無水葡萄糖、硫酸鋅、無水乙醇等：分析純，廣州湘喜生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設備

中藥粉碎機：119型，浙江瑞安永歷制藥機械；

紫外可見分光光度計：UV-2350型，上海尤尼柯儀器有限公司；

鼓風干燥箱：DHG9070型，上海齊欣科學儀器有限公司；

數顯恒溫水浴箱：600型，維城試驗器材有限公司；

電子天平：JA2003型，上海精密科學儀器廠；

高速臺式離心機：TGL-16G型，上海安亭儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛹蟲草多糖制備工藝流程

蛹蟲草子實體粉末→水浴浸提→過濾→清液→濃縮→醇沉→離心→沉淀→烘干→去離子水復溶→去蛋白→離心→沉淀→烘干→蛹蟲草多糖

1.3.2 樣品糖含量和蛋白質含量測定

（1）總糖測定：硫酸苯酚法［9］；

（2）還原糖測定：3，5-二硝基水楊酸比色法［10］；

（3）蛋白質測定：考馬斯亮藍比色法［11］；

（4）多糖含量測定：樣品中總糖含量減去樣品中還原糖的含量，即：多糖含量＝總糖含量－還原糖含量。（5）多糖提取率的測定：按式（1）計算。

1.3.3 蛹蟲草多糖提取單因素試驗

（1）提取溫度單因素試驗：稱取6份質量為5g的蛹蟲草子實體粉末，每份按照液料比30∶1（V∶m）加入蒸餾水，分別置于溫度為40，50，60，70，80，90℃的水浴中進行多糖的提取，2h后以250mL離心杯在4 000r/min轉速下離心20min，將上清液定容至200mL容量瓶中，取適量樣液進行總糖及還原性糖的含量測定，計算多糖提取率，考察提取溫度對多糖提取率的影響［12］。

（2）提取時間單因素試驗：稱取5份質量為5g的蛹蟲草子實體粉末，每份按照液料比30∶1（V∶m）加入蒸餾水，置于提取溫度為70℃的水浴中分別進行1，2，3，4，5h的多糖提取，然后以250mL離心杯在4 000r/min轉速下離心20 min，將上清液定容至200mL容量瓶中，取適量樣液進行總糖及還原性糖的含量測定，計算多糖提取率，考察提取時間對多糖提取率的影響。

（3）液料比單因素試驗：稱取6份質量為5g的蛹蟲草子實體粉末，分別按照液料比10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，5 0∶1，60∶1（V∶m）加入蒸餾水，置于提取溫度為70℃的水浴中分別進行多糖的提取，2h后以250mL離心杯在4 000r/min轉速下離心20min，將上清液定容至200mL容量瓶中，取適量樣液進行總糖及還原性糖的含量測定，計算多糖提取率，考察液料比對多糖提取率的影響。

1.3.4 蛹蟲草多糖提取正交試驗 在單因素試驗的基礎上，選取3個因素，每個因素選取3個水平，進行L9（34）正交試驗優化蛹蟲草多糖的提取條件。

1.3.5 多糖提取液的醇沉工藝

（1）濃縮液濃度的影響：按照正交試驗優化的最佳條件進行蛹蟲草多糖的水浴提取，將提取液分別濃縮至8%，10%，12%，14%，17%的濃度，分別加入3倍體積的無水乙醇。置于4℃冰箱中醇沉8h，然后在4 000r/min下離心2 0min，收集沉淀物，干燥即得粗多糖，稱重計算提取率，考察濃縮液濃度對多糖提取率的影響。

（2）乙醇濃度的影響：按照正交試驗優化的最佳條件進行蛹蟲草多糖的水浴提取，將提取液濃縮至14%的濃度分別加入無水乙醇，使乙醇的最終濃度達到50%，60%，70%，80%，90%。置于4℃冰箱中醇沉8h，然后在4 000r/min下離心20min，收集沉淀物，干燥即得粗多糖，稱重計算提取率，考察乙醇濃度對多糖提取率的影響［13］。

1.3.6 多糖的去蛋白工藝

（1）pH的影響：用蒸餾水將在上述最優條件下獲得的蛹蟲草多糖溶解并定容至500mL，吸取體積為30mL的多糖溶液5份，分別調節pH值為1，2，3，4，5。置于4℃冰箱中沉淀8h，然后在4 000r/min下離心20min，取上清液測定蛋白質和多糖含量，考察pH對蛋白脫除率和多糖保留率的影響［14］。

（2）硫酸鋅的影響：用蒸餾水將上述最優條件下獲得的蛹蟲草多糖溶解并定容至500mL，吸取體積為30mL的多糖溶液5份，調節pH值至3，加入硫酸鋅使其質量分數分別為2%，4%，6%，8%，10%。放置在4℃冰箱中沉淀8h，然后在4 000r/min下離心20min，取上清液測定蛋白質和多糖含量，考察不同質量分數的硫酸鋅對蛋白脫除率和多糖保留率的影響。

1.3.7 數據處理 以上所有試驗數據平行測定3次，結果用平均值±標準偏差表示，采用Statistica 6.0軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線及回歸方程

2.1.1 總糖 根據硫酸苯酚法測定總糖含量并繪制總糖標準曲線，求得回歸方程為Y（吸光度）＝10.35X（總糖濃度，m g/mL）－0.006，r2＝0.998，說明總糖濃度在規定范圍內線性良好。

2.1.2 還原糖 根據3，5-二硝基水楊酸測定還原糖含量并繪制還原糖標準曲線，求得回歸方程為Y（吸光度）＝0.573 6X（還原糖濃度，mg/mL）－0.010 3，r2＝0.998 3，說明還原糖濃度在規定范圍內線性良好。

2.1.3 蛋白質 根據考馬斯亮藍法測定蛋白質含量并繪制蛋白質標準曲線，求得回歸方程為Y（吸光度）＝4.792 9X（蛋白質濃度，mg/mL）－0.000 5，r2＝0.999 1，說明蛋白質濃度在規定范圍內線性良好。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取溫度的影響 由圖1可知，在選取的水平范圍內隨著提取溫度的上升，蛹蟲草多糖的提取率基本呈現增加的趨勢。提取溫度的升高可以加劇多糖分子的運動，促使多糖從細胞進入溶液中［15］。提取溫度在70℃之前，隨著溫度的升高，提取率增加明顯；在70℃之后，多糖的提取率趨于平穩。因此，選擇60，70，80℃進行正交試驗。

2.2.2 提取時間的影響 由圖2可知，在選取的水平范圍內隨著提取時間的增加，蛹蟲草多糖的提取率呈現了先增后減的現象。多糖的溶解平衡需要一定的時間，在達到平衡前隨著時間的增加，多糖溶出更多因此提取率也越大；但到達平衡后多糖的溶出量基本趨于穩定，提取率增加幅度變小，再延長提取時間甚至還會導致多糖出現不穩定而降解，導致提取率下降［16］。從圖2還可以看出，提取時間在3h之前，隨著時間的增加多糖提取率增加明顯，在3～4h時，提取率增加幅度已經很小，并且達到最大值；在4h之后提取率出現了下降。因此選取提取時間2，3，4h這3個水平進行正交試驗。

2.2.3 液料比的影響 由圖3可知，在選取的水平范圍內隨著料液比的增加，蛹蟲草多糖的提取率基本保持了增加的趨勢。在一定質量的原料中加入更多的提取溶劑，能促進原料與溶劑的接觸，增加多糖的溶出使提取率升高［17］。當液料比從10∶1（V∶m）增加到30∶1（V∶m）時，多糖的提取率上升明顯；在30∶1（V∶m）之后再增加液料比提取率已經變化很小。因此，選擇20∶1，30∶1，40∶1（V∶m）的液料比水平進行正交試驗。

圖1 提取溫度對蛹蟲草多糖提取率的影響Figure 1 Effect of temperature on polysaccharide extraction yield

圖2 提取時間對蛹蟲草多糖提取率的影響Figure 2 Effect of time on polysaccharide extraction yield

圖3 液料比對蛹蟲草多糖提取率的影響Figure 3 Effect of liquid to material on polysaccharide extraction yield

2.3 正交試驗

在單因素基礎上確定的正交試驗因素及水平設計見表1，試驗結果及數據方差分析見表2、3。

表1 正交試驗因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

＊差異顯著。

離差來源 偏差平方和 自由度 方差 F值 P值提取溫度 0.515 2 0.257 58.068 0.017＊ 液料比 0.252 2 0.126 28.474 0.034＊提取時間 0.184 2 0.092 20.774 0.046＊隨機誤差0.009 2 0.004總和0.960 8

由表2、3可知，影響蛹蟲草多糖提取率的主次因素排序為提取溫度＞液料比＞提取時間，且3個因素對多糖提取率的影響都達到顯著水平。最優組合為A3B2C3，即提取溫度80℃、液料比30∶1（V∶m）和提取時間4h。

按照正交優化的最佳工藝進行驗證性實驗，多糖提取率均值為9.16%，比正交試驗組中A2B2C3條件下8.97%的提取率還高0.19%，因此選擇A3B2C3，即提取溫度80℃、液料比30∶1（V∶m）和提取時間4h為最優的蛹蟲草多糖提取條件，整個試驗誤差小，方法穩定。

2.4 醇沉工藝結果

2.4.1 濃縮液濃度的影響 由圖4可知，隨著濃縮液濃度的增加，醇沉后多糖的提取率呈現上升趨勢。當濃度由8%增加到14%時提取率上升顯著，而濃度達到14%后增加幅度已經變得平緩。綜合考慮濃縮的成本及繼續濃縮可能會析出晶體，選擇14%的濃縮液濃度為最佳條件。

2.4.2 乙醇濃度的影響 由圖5可知，隨著乙醇濃度的增加，醇沉后多糖的提取率呈現上升趨勢。乙醇濃度由50%增加到80%過程中，提取率增加明顯；當達到80%以后，再增加乙醇的濃度，提取率也變化不大接近平衡。因此選擇乙醇濃度為80%作為最佳的醇沉條件。

圖4 濃縮液濃度對多糖提取率的影響Figure 4 Effect of extract concentration on polysaccharide extraction yield

圖5 乙醇濃度對多糖提取率的影響Figure 5 Effect of ethanol concentration on polysaccharide extraction yield

2.5 脫蛋白工藝結果

2.5.1 pH的影響 由圖6可知，隨著pH值的降低，蛋白質的脫出率呈現增加趨勢。但是這個過程中，多糖的保存率也表現出慢慢下降的趨勢，即多糖的損失也會加大。在較低的pH酸性條件下，多糖分子容易發生水解損失。綜合考慮在pH＝3時，蛋白脫除率較好而多糖基本沒有損失［18］。

圖6 pH對蛋白質脫除率和多糖保留率的影響Figure 6 Effect of pH on protein removal rate and opolysaccharide extraction yield

2.5.2 硫酸鋅的影響 由圖7可知，隨著硫酸鋅質量分數的升高，蛋白質脫除率在剛開始時上升明顯，但達到4%后蛋白質脫除率基本趨于穩定。對于多糖保存率，當硫酸鋅質量分數超過4%之后出現了明顯的下降。綜合考慮選擇4%的硫酸鋅作為最佳鹽析條件［12］。

圖7 硫酸鋅對蛋白質脫除率和多糖保留率的影響Figure 7 Effect of Mass fraction of Zinc Sulfate on protein removal rate and opolysaccharide extraction yield

3 結論

本試驗以蛹蟲草子實體為原料，對蛹蟲草多糖進行提取純化的工藝研究，尋找蛹蟲草多糖的最佳制備條件。結果表明：最佳工藝為先在液料比30∶1（V∶m）、提取溫度70℃和提取時間4h下提取多糖，然后在濃縮液濃度為14%、乙醇溶液濃度為80%下進行醇沉，再調節多糖溶液的pH＝3并加入4%的硫酸鋅。整個工藝多糖提取率為8.97%，純度高達68.9%，有良好的去雜純化效果且多糖損失較小。該研究為產業化生產蛹蟲草多糖提供了基礎數據。

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