硝化細菌包埋固定化條件的研究

南曉梅，宋新山，趙曉祥

(東華大學 環境科學與工程學院，上海 201620)

目前，隨著水體富營養化現象的日趨嚴重，廢水生物脫氮技術作為一種高效、環保的污水處理技術，逐漸成為水處理領域關注的焦點，硝化細菌是被廣泛應用于水體除氮的菌種［1］。微生物固定化技術經過特定的技術方法將細菌細胞固定化在所選擇的載體上，優點是能夠防止發生菌體流失現象，并提高細菌的可利用率，從而達到簡化處理工藝，提高應用效率的目的［2］。包埋法是將微生物菌株包埋在半透性的聚合物凝膠或膜內，或使微生物細胞分散進入多孔性的載體內部，包埋法固定微生物是一種當前被普遍應用的固定化方法［3-4］。

本實驗采用聚乙二醇和海藻酸鈉為載體，對Y1菌株進行包埋固定化實驗，以Y1 菌株降解氨氮的效率為實驗指標進行降解正交實驗，研究各種包埋固定化條件因素對固定化小球降解效率的影響。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

硝化細菌Y1 菌株，從污水處理廠的活性污泥中分離;聚乙二醇(PEG)，生化試劑;海藻酸鈉(SA)，化學純;氯化鈣，分析純;氨氮廢水，采用人工配水，成分［5-6］為:蔗糖223 mg/L，NH4Cl 191 mg/L，NaHCO3500 mg/L，MgSO412. 5 mg/L，KH2PO420 mg/L，FeSO45 mg/L，CaCl25 mg/L，微量元素1.0 mL/L。微量元素為:H3BO3150 mg/L，ZnCl250 mg/L，CuCl220 mg/L，MnSO4·H2O 50 mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 60 mg/L，CoCl2·6H2O 150 mg/L，FeCl350 mg/L 和NiCl240 mg/L。

1.2 固定化顆粒制備

1.2.1 菌懸液的制備 將恒溫培養24 h 的細菌培養液裝入離心管，以8 000 r/min 的速度離心10 ～20 min，棄去上清液，用無菌生理鹽水洗滌后，再反復離心3 ～4 次，最后用去離子水稀釋，制成菌懸液。

1.2.2 固定化載體的處理 分別取一定克數的PEG 和SA，加入錐形瓶中，并加入100 mL 去離子水，121 ℃滅菌20 min，使其完全混合。

1.2.3 交聯劑的制備 取一定克數CaCl2，加入到100 mL 去離子水中，完全溶解后高溫滅菌備用。

1.2.4 固定化小球的制備 將菌懸液倒入冷卻后的PEG 和SA 載體混合液中，攪拌使其混合均勻。用注射器將混合液注入到CaCl2交聯劑溶液中，冰浴，邊滴邊攪拌，使滴入液形成2 ～3 mm 的小球，4 ℃交聯后用去離子水洗滌，得到固定化顆粒。

1.3 分析方法

各種指標的測試方法如下:pH 值，玻璃電極法;氨氮，采用氣相分子吸收光譜法進行測定。

2 結果與討論

2.1 固定化顆粒的外部形態

細菌固定化小球形態見圖1。

圖1 PEG 和SA 的固定化微球Fig.1 Picture of immobilized microspheres of PEG and SA

由圖1 可知，PEG 和SA 包埋的固定化小球成型狀況良好，粒徑大小均勻，直徑3 ～4 mm，為白色半透明狀。

2.2 聚乙二醇濃度對固定化小球成球效果的影響

聚乙二醇濃度為1.0% ～8.0%，海藻酸鈉濃度為3.0%，菌懸液添加量為50%，CaCl2交聯劑濃度為4%，交聯時間5 h，成球情況見表1。

表1 聚乙二醇對固定化的影響Table 1 Effect of PEG on immobilization

成球狀態較好的固定化小球應該具有較好的傳質性能和機械強度［7］。機械強度越大，說明固定化小球越堅固，可在降解中重復使用。滲透時間越小，說明固定化小球所包埋的內部細菌越容易與外部污染物進行反應，對外部污染物進行降解。由表1 可知，PEG 濃度小于3.0%時，固定化小球會不易形成或出現拖尾現象;PEG 濃度為4.0%以上時，小球的機械強度會開始增大，到PEG 濃度為8.0%時，達到62.01 g 的最大值。小球的破碎率在PEG 為8.0%時降為0。綜合以上各方面因素，本實驗的PEG 濃度范圍選定為4.0%，6.0%和8.0%。

2.3 海藻酸鈉濃度對固定化小球成球效果的影響

選擇濃度1.0% ～7.0%的海藻酸鈉和5.0%的聚乙二醇混合溶液作為復合載體包埋劑，菌液添加量為50%，交聯劑為4% 的CaCl2溶液，交聯時間5 h，成球情況見表2。

表2 海藻酸鈉對固定化的影響Table 2 Effect of SA on immobilization

由表2 可知，隨著SA 濃度的增加，小球的機械強度隨之增加，相反，滲透性隨之降低，從5.0%濃度開始其滲透性有明顯下降，15 min 內固定化小球才能夠被完全滲透。總結以上結果，海藻酸鈉的濃度范圍選擇為2.0% ～4.0%。

2.4 交聯劑濃度對固定化小球成球效果的影響

聚乙二醇濃度6%，海藻酸鈉3%，菌懸液添加量為50%，交聯時間5 h，交聯劑濃度為1% ～6%，分別測定小球的機械強度、滲透性以及破碎率，結果見表3。

表3 交聯劑對固定化的影響Table 3 Effect of cross-linking on immobilization

由表3 可知，隨著交聯劑濃度的增加，小球的機械強度、滲透時間隨之增加，但是增加程度不是很大，這說明交聯劑濃度對固定化小球的性能影響相對于其他因素較小。綜合以上結果，交聯劑濃度范圍確定為4.0% ～6.0%。

2.5 交聯時間對固定化小球成球效果的影響

聚乙二醇濃度為6%，海藻酸鈉為3%，菌懸液添加量為50%，每隔5 h 取出小球測定機械強度、滲透性及破碎率，結果見表4。

表4 交聯時間對固定化效果影響Table 4 Effect of cross-linking time on immobilization result

由表4 可知，隨著交聯時間的增加，小球內部包埋材料逐漸形成穩定的框架結構，固定化小球的機械強度逐漸增大，破碎率從開始的31.67%最終降低至0，而滲透時間也會隨著交聯時間的增加而增加。當交聯時間為15 h 以下時，固定化小球的機械強度很小，破碎率比較高;交聯時間在35 h 和40 h時，雖然破碎率降至0，但是小球的滲透性能較差。確定交聯時間為15 ～25 h 進行正交實驗。

2.6 正交實驗

以初始氨氮濃度為10 mg/L 的氨氮降解率為實驗指標，對聚乙二醇濃度、海藻酸鈉濃度、交聯劑的濃度和交聯時間進行正交實驗，研究固定化細菌的最佳包埋條件。各因素水平見表5，結果見表6。

表5 因素水平Table 5 Factors and levels

表6 正交實驗結果Table 6 Results of orthogonal experiment

由表6 可知，4 個因素的最優水平是A3B2C1D2，即聚乙二醇濃度8%，海藻酸鈉濃度3%，交聯劑濃度4%，交聯時間為20 h。4 因素影響的主次順序是A ＞B ＞C ＞D，即聚乙二醇濃度的影響最大，然后是海藻酸鈉濃度，而CaCl2濃度和交聯時間對固定化小球的成球效果影響最小。實驗結果的方差分析見表7。

表7 固定化小球正交實驗方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal experiment

由表7 可知，4 種因素的F 值全部小于Fa的值，即4 種因素對固定化小球降解效率不會產生顯著影響。

3 結論

以固定化菌株氨氮降解率為指標進行正交實驗，結果顯示，聚乙二醇濃度8%，海藻酸鈉濃度3%，CaCl2濃度4%，交聯時間20 h 為最佳固定化條件。其中，聚乙二醇濃度的影響最大，然后是海藻酸鈉濃度，而CaCl2濃度和交聯時間對固定化小球的成球效果影響最小。4 種因素對固定化小球降解效率的影響均不顯著。

［1］ 任海波.養殖廢水氨氮降解菌的分離、鑒定與固定化研究［D］.青島:中國海洋大學，2004.

［2］ 申婷婷，李小明，岳秀，等. 微生物固定化技術的研究與應用［J］.廣州化工，2011，39(20):3-5.

［3］ Cao Guomin，Zhao Qingxiang，Sun Xianbo，et al. Characterization of nitrifying and denitrifying bacteria coimmobilized in PVA and kinetics model of biological nitrogen removal by coimmobilized cells［J］.Enzyme and Microbial Technology，2002，30(8):49-55.

［4］ Seo Jaekoan，JungⅡhyong，Kim Miryung，et al. Nitrification performance of nitrifiers immobilized in PVA for a marine recirculating Aquarium system［J］. Aquacultural Engineering，2001，24(3):181-194.

［5］ Shi Xianyang，Yu Hanqing，Sun Yujiao，et al.Characteristics of aerobic granules rich in autotrophic ammonium-oxidizing bacteria in a sequencing batch reactor［J］.Chemical Engineering Journal，2009，147:102-109.

［6］ 魏俊虎. 脫氮除磷菌的馴化分離及其性能優化研究［D］.上海:東華大學，2011.

［7］ 魏宏斌，陳世和. 廢水生物處理中固定化技術的研究與應用［J］.江蘇環境科技，1996，9(2):10-14，22.