共價負載阿霉素栓塞微球的制備及緩釋性能研究

張猛，李旺，張亞南，王潔，倪才華

(江南大學 化學與材料工程學院 食品膠體與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

聚乙烯醇是一種水溶性高分子材料，無毒無害、無刺激性、有良好的生物相容性［1］，被廣泛用作醫用材料，它的用處之一是作為血管栓塞劑用于腫瘤治療。動脈栓塞技術是選擇性地將栓塞劑注入病變靶區供血動脈、阻斷血流，以達到治療惡性腫瘤的目的［2-3］。有關栓塞微球的研究已有許多報道［4-5］。普通的栓塞微球不載藥，在治療癌癥的過程中需要的周期較長。而載藥栓塞微球除了物理栓塞作用外，還具有向靶向部位釋放藥物的功能，因而可以提高治療效果，降低普通化療藥物的毒副作用。

目前已知的載藥栓塞微球多是把抗癌藥物直接包埋于微球之中［6-7］，這樣既造成了合成過程中的藥物浪費，又不利于載藥微球的長期保存。故設計一種便于保存、負載藥物能力強的血管栓塞劑成為必然。本研究選擇PVA 為主體材料，首先將其制備成粒徑合適的微球，然后通過微球表面反應，使其帶上酰肼基團［8-9］，得到功能化的PVA 微球。阿霉素分子中的羰基能與肼基反應生成腙，腙鍵可以斷裂，并釋放出藥物。期望通過這種設計達到栓塞微球在被使用前快速共價負載藥物的目的，從而避免在存放過程中的藥物流失。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

0588 聚乙烯醇，工業品;石蠟油，化學純;司班80、36%甲醛溶液、丁二酸酐、80%水合肼均為分析純;鹽酸阿霉素，上海灝云化工科技有限公司。

Nicolet 6700 全反射傅里葉紅外光譜儀;VHX-1000C 超景深三維顯微鏡;UV2450 紫外分光光度計。

1.2 實驗方法

功能化PVA 微球的合成及藥物負載路線如下:

圖1 聚乙烯醇(PVA)微球的藥物負載示意圖Fig.1 Process of polyvinyl alcohol microspheres loading drugs

合成機理:通過對交聯聚乙烯醇微球(CPVA)上的羥基(—OH)進行修飾改性，引入酰肼基團;酰肼可以與阿霉素中的羰基鍵共價結合生成腙鍵，從而達到共價負載阿霉素的目的。

1.2.1 PVA 微球的制備 在250 mL 的燒杯中加入50 mL 石蠟油，機械攪拌下依次滴加1.50 g 司班80 和10 mL PVA(15%)，30 min 后滴加0.8 g 甲醛溶液和1.0 mL 鹽酸，反應3 h。用乙醇破乳，洗滌，真空干燥后即可得到CPVA 微球［10］。

1.2.2 微球表面的功能化 取3.0 g 丁二酸酐和0.8 g 的二甲基氨基吡啶(DMAP)在機械攪拌下加入到50 mL 吡啶溶液中，待完全溶解后加入CPVA微球，反應10 h。過濾、乙醇洗滌，干燥至恒重。

在三口燒瓶中加入上述微球和27.6 g 乙醇，磁力攪拌下依次加入25 mL 環己烷、3.0 g 一水合硫酸氫鈉，于70 ℃下反應6 h。加入飽和碳酸氫鈉溶液中和，過濾、乙醇洗滌并真空干燥。

在燒杯中加入乙酯化的上述微球和80 mL 乙醇、12 g 水合肼(80%)，于40 ℃反應5 h。過濾、真空干燥，即得表面酰肼功能化的PVA 微球。

1.2. 3 栓塞微球的載藥及釋放 配制50 mL 0.2 mg/mL 的阿霉素溶液，調節pH 值至中性后，加入改性PVA 微球，常溫下反應24 h，經過濾、冷凍干燥即得到載藥微球。

稱取150 mg 的載藥微球，分成等量的5 份，分別放入pH 值為4.0，5.0，6.0，7.0 和7.4 的PBS 溶液中，進行藥物釋放。在不同的時間點用紫外分光光度計測量溶液中阿霉素(DOX)的含量。

2 結果與討論

2.1 微球合成條件探討

在合成微球的過程中，交聯劑的加入量會影響微球的形狀和性能。當甲醛加入量為0.8 g 時，微球分散均勻、外觀圓整且相互之間不粘連(圖2a);而當甲醛加入量為0.7 g 時，微球之間就會出現粘連且有塊狀物生成(圖2b)，這是由于聚乙烯醇中的羥基交聯反應的量過少，導致其強度無法維持微球的形狀和性能。

圖2 PVA 栓塞微球形貌圖Fig.2 Images of PVA embolic microspheres

2.2 紅外譜圖

由圖3 可知，在b 和c 中出現較強的羰基伸縮振動吸收峰1 750 cm－1，而在未功能化到PVA 中，此峰較弱，只有原料中極少量未醇解的羰基峰。同時，3 000 ～3 300 cm－1之間的弱峰是酰胺中N—H特征吸收峰，這一結果確證PVA 表面增加了功能基團。再對比b 和c 譜圖:c 中2 960，3 300 cm－1處的尖峰是腙鍵和阿霉素中胺基的特征吸收峰，同時在1 600 ～1 750 cm－1之間出現的多個弱峰，是阿霉素中不同羰基的特征吸收峰，表明雙鍵的存在，由此也證明了阿霉素的成功載入。

圖3 微球的紅外譜圖Fig.3 FTIR of microspheres

2.3 形貌分析

圖2c，d 分別是負載阿霉素前后的PVA 微球照片。對比兩照片可以看出載藥后的微球表面顏色明顯加深，微球表面也相對比較粗糙，這是微球接枝改性和載入阿霉素所導致的結果。

2.4 粒徑分析

研究了油水比對微球的粒徑影響。在光學顯微鏡下，隨機測量500 個微球的直徑，結果見表1。

表1 不同條件下微球的分布情況Table 1 Distribution of microspheres under different conditions

由表1 可知，分散相(油)的體積比例越大，得到的微球粒徑越小。

選用油水比為5∶1 時得到的微球作粒徑分布分析，結果見圖4。

圖4 微球的粒徑分布圖(油水比為5∶1)Fig.4 Image of particle size distribution

由圖4 可知，微球粒徑基本上分布在100 ～700 μm 之間，最大分布在350 μm 左右。

2.5 控制釋放

載藥后的溶液藥物經紫外分析得到:包封率=負載的藥物質量/藥物加入總質量=61%;載藥率=負載的藥物質量/微球質量=4.7%。每毫升微球約700 mg，按毫升計量:每毫升微球的載阿霉素的量為32.9 mg。按照普通分子運動機理分析，阿霉素分子會在微球浸泡過程中擴散入其中，但是考慮到交聯聚乙烯醇微球的自身特性以及本研究中在短短24 h 之內負載如此高的藥物量，絕不是普通的單一物理負載所能相較，這也正是化學共價負載的優勢所在。

圖5 是共價負載阿霉素栓塞微球在不同pH 的PBS 緩沖溶液中對阿霉素的釋放圖。

圖5 載藥微球對阿霉素在不同pH 值條件下的累計釋放圖Fig.5 Release profile of DOX from drug-loaded microspheres at different pH values

由圖5 可知，隨著pH 值的降低，載藥微球對阿霉素的釋放速度越快，且釋放量也越多。這一趨勢是腙鍵在酸性條件下斷裂結果，且在72 h 內基本完成了對阿霉素的釋放。

3 結論

采用反向懸浮聚合的方法制備出球形度良好的交聯聚乙烯醇微球。通過微球表面羥基與乙酸酐反應，并依次經過酯化、酰肼化后，得到功能化栓塞微球。該微球可快速共價負載阿霉素。隨著介質pH的降低，阿霉素的釋放速度加快、累計釋放量增大。

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