正交實驗法優選當歸多糖的提取工藝

袁菊麗，劉峰林

(甘肅中醫學院 教學實驗中心，甘肅 蘭州 730000)

當歸［Angelica sinensis (Olive.)Diels］屬傘形科的一種多年生草本植物，別稱秦歸、云歸、西當歸、岷當歸，尤以甘肅岷縣所產當歸藥效最好。當歸在我國臨床經常用在中藥的復方和驗方中。隨著對中藥的不斷開發和利用，當歸的有效成分逐漸被分離、純化，并對其進行相應的結構鑒定。當歸多糖是當歸中主要生物活性物質［1］。當歸多糖的分離多采用水提、醇沉和離子交換樹脂和凝膠樹脂等方法［2］。生物學和藥理學研究結果表明，當歸多糖在抗腫瘤、肝損傷、免疫方面有明顯的作用［3-6］。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

當歸藥材，購自甘肅岷縣當歸城，經鑒定為傘形科植物當歸［Angelica sinensis(Oliv.)Diels］的根;葡萄糖對照品(G0 50500 中檢所);濃硫酸、苯酚、乙醇等均為分析純。

PL601 電子天平;CP124C 分析天平;UV-3300紫外可見分光光度計;G10-1 離心機。

1.2 當歸多糖的提取

稱取2 g 當歸藥材粉末，置索氏提取器中，依次用石油醚、無水乙醇回流提取至無色。所得藥渣蒸餾水加熱回流提取2 h，得濾液，定容至100 mL 容量瓶中，混勻后取5 mL 加醇至醇沉濃度為70%，靜置過夜，離心得沉淀，加蒸餾水至50 mL 容量瓶中定容。

1.3 分析方法

多糖測定方法有苯酚-硫酸法、硫酸-蒽酮法和3，5-二硝基水楊酸法［2］。根據預實驗結果，選用苯酚-硫酸法。

1.3.1 對照品溶液的制備稱定105 ℃干燥至恒重的葡萄糖50 mg，定容至100 mL。

1.3.2 確定最大吸收波長分別取1 mL 的當歸樣品溶液，對照品溶液，蒸餾水，依次加入1 mL 的5%苯酚溶液，7 mL 的濃硫酸，混勻后沸水浴加熱30 min后冷卻至室溫，在400 ～600 nm 掃描以確定最大吸收波長［3］。結果表明，492 nm 為最大吸收波長。

1.3.3 葡萄糖標準曲線的繪制量取對照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中定容。取溶液各2 mL，分別加入5%苯酚1 mL，混勻后迅速加入5 mL 濃硫酸，混勻，1 ～2 min后于沸水液中加熱30 min，取出自然冷卻60 min。在492 nm 波長處測定其吸光度，以吸光度A 對應濃度Y 回歸，得回歸方程Y =0.412 0A +0.196 2(r =0.999 5)，線性范圍0.020 2 ～0.141 3 mg/mL。

1.3.4 供試液中總多糖含量的測定量取供試液2 mL，按“標準曲線”項下操作，測定吸光度A 值，并代入回歸方程，計算多糖含量。

多糖得率=沉淀重×多糖含量/藥材的質量×100%

2 結果與討論

根據預實驗結果，采用正交實驗，以提取時間、提取次數、加水量及醇沉濃度作為考察因素，每個因素分設3 個水平，選用L9(34)正交表。以當歸多糖的得率作為評價指標，因素水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

取當歸多糖粗粉9 份，每份10 g，85%乙醇熱回流2 次(3，2 h)，每份100 mL，去除單糖、低聚糖及苷類等干擾性成分［2］。藥渣按正交實驗設計方案進行提取，水提液濃縮至每毫升含生藥0.5 g，按正交設計的醇沉濃度醇沉，沉淀分別用適量的無水乙醇、乙醚、丙酮依次洗滌后50 ℃烘干得粗多糖。稱定所得粗多糖12.5 mg 于50 mL 容量瓶中定容得供試液。按標準曲線項下含量測定方法測定，并計算多糖含量和多糖得率，結果見表2。

表2 L9(34)正交實驗結果Table 2 The results of L9(34)orthogonal experiment

由表2 可知，影響當歸多糖得率的因素主次順序為:B ＞C ＞D ＞A，各因素水平的顯著性方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果Table 3 ANOVA table

由表2 可知，提取次數對多糖得率有顯著性的影響，最優工藝為A3B3C2D1，即加12 倍量水，提取2次，每次2 h，醇沉濃度為70%。

對確定的工藝進行3 次驗證性實驗，多糖得率平均值為2.65%，相對標準偏差RSD 為2.28%，結果穩定，說明該工藝切實可行。

3 結論

(1)當歸多糖水提醇沉的最優工藝條件為:加12 倍量水，提取2 次，每次2 h，醇沉濃度為70%，當歸多糖的平均得率可達2.65%。

(2)當歸多糖的水提醇沉方法簡便，無需特殊設備，所用溶劑易得價廉，且多糖得率高，具有成本低、產品得率高的顯著優點，具有很好的應用前景。

［1］ 楊帆，肖遠勝，章飛芳，等.當歸化學成分的HPLC-MS/MS 分析［J］.藥學學報，2006，41(11):1078-1083.

［2］ 劉云.當歸多糖的提取及含量測定［J］.現代中藥研究與實踐，2003，17(1):49-50.

［3］ 楊鐵紅，賈敏，梅其炳.當歸多糖組分AP=3 誘惑小鼠脾細胞IL-2 和IFN-Y 的作用［J］. 藥學學報，2006，41(1):54-57.

［4］ 胡晶，吳宏. 當歸多糖對小鼠外周血造血干細胞動員作用的研究［J］.中草藥，2006，37(12):1835-1838.

［5］ 胡小平，李玉云，李先何.當歸多糖成分及藥理學研究新進展［J］.中藥材，2014，27(1):70-72.

［6］ 趙雪梅，劉吉成. 當歸多糖對小鼠體外周造血干細胞動員作用的研究［J］. 中草藥，2006，37(12):1835-1838.