用HPLC 測定羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯含量的研究

李宗霖，麻紀斌，曲秦，翟帆，舒泉湧，秦湫紅

(陜西新藥技術開發中心，陜西 西安 710075)

對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯是合成4-(4-胍基苯酰氧基)苯乙酸-N，N-二甲基氨基甲酰甲酯甲磺酸鹽(甲磺酸卡莫司他)的中間體，甲磺酸卡莫司他是日本小野藥品工業研究所開發的非肽類蛋白酶抑制劑，臨床用于慢性胰腺炎的治療，對胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶、激肽釋放酶、凝血酶等有很強的抑制作用［1-2］。

對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯作為甲磺酸卡莫司他的重要中間體，它的控制方法對甲磺酸卡莫司他的合成具有很大影響［3-4］。由于合成工藝過程中可能引入副產物［5］，而且作為中間控制，快速、簡便、準確的測定方法對于中間體的質量控制具有不可替代的作用。本文建立了HPLC 檢測對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯的方法，為其工業生產質量控制提供了有效依據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯對照品，自制，含量98.5%;對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯，自制;純凈水;乙腈，色譜純。

Ag135 電子天平;Thermo Ultimate 3000 高效液相色譜儀;KQ-300VDE 型雙頻數控超聲波清洗器;VARIAN cary 50 紫外可見分光光度計。

1.2 溶液配制

1.2.1 對照品溶液的制備精密稱取對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯對照品10. 0 mg，置50 mL容量瓶中，加入乙腈/水(流動相)適量，超聲5 min 使溶解后，用流動相稀釋至刻度，搖勻。精密吸取1 mL 至10 mL 容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。

1.2.2 供試品溶液的制備精密稱取對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯樣品10.0 mg，置50 mL容量瓶中，加流動相適量，超聲5 min 使溶解后，用流動相稀釋至刻度，搖勻。精密吸取1 mL 至10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇以乙腈水為溶劑，配制對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯的溶液，在190～400 nm 波長下連續掃描，發現其最大吸收波長為275 nm。因此，確定檢測波長為275 nm。

2.1.2 流動相配比的選擇在HPLC 檢測中，乙腈具有較低的吸光度，洗脫能力也較強，因此采用乙腈-水為流動相。為確保對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯與雜質的完全分離，以不同配比的乙腈與水進行實驗，最后確定流動相配比為:乙腈∶水=30∶70(V/V)。

2.1.3 色譜條件色譜柱為Thermo Syncronis C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(30∶70，V/V)，檢測波長為275 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系精密稱取對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯對照品10.0 mg，置100 mL 容量瓶中，加流動相適量，超聲5 min 使溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即為對照品儲備液。從對照品儲備液中精密量取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，用流動相稀釋定容至10 mL 容量瓶中，得一系列不同質量濃度的對照品溶液。分別精密量取20 μL 進樣測定。以進樣量(μg)為橫坐標，對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯峰面積(mAU ×min)為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸，得方程:y = 0.971 0 x－0.002 3，R2= 0.999 9。對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯在0.2 ～1.0 μg 范圍內線性關系良好。2.2.2 精密度實驗精密量取對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯對照品溶液，按上述色譜條件，分別重復測定5 次，結果見表1。

表1 精密度考察結果Table 1 Results of precision experiment

由表1 可知，對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯峰面積的RSD 為1.69%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重現性實驗精密稱取同一批樣品5 份，按供試品溶液制備方法平行處理并測定，結果見表2。

表2 重現性考察結果Table 2 Results of repeatability experiment

由表2 可知，對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯峰面積的RSD 為2.23%，表明本方法重復性良好。

2.2.4 穩定性實驗精密稱取同一批樣品，制成供試液，分別于0，2，4，8，12 h 測定峰面積，結果見表3。

表3 穩定性考察結果Table 3 Results of stability experiment

由表3 可知，對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯峰面積的RSD 為2.27%，說明供試液在12 h內穩定性良好。

2.2. 5 加樣回收率實驗精密稱取已知含量(97.5%)的同一批對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯樣品9 份，每份約0.10 g，分別精密加入一定量的對照品，制備成供試品溶液后，精密量取5.0 mL，置于100 mL 容量瓶中，按色譜條件測定，結果見表4。

表4 回收率實驗結果(n=9)Table 4 Results of recovery experiment (n=9)

2.3 樣品測定

取對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯及3批次樣品，按外標法以峰面積計算含量，結果見圖1、圖2。

圖1 對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯對照品色譜圖 Fig.1 The chromatogram of reference of N，N- dimethylcarbamoylmethyl-p-hydroxyphenylacetate

圖2 對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of sample of N，Ndimethylcarbamoylmethyl-p-hydroxyphenylacetate

3 結論

采用HPLC 法分析對羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯含量，線性關系良好，主要成分和雜質分離完全，分析時間短，精密度和重現性高，具有快速、簡便、準確等特點，適用于工業生產過程中的質量控制和產品的質量分析。

［1］ Hashimoto K.Camostat mesilate［J］.Drugs of the Future，1985，10(11):897-899.

［2］ Asami T，Tomisawa Y，Uchiyama M. Effect of oral camostat mesilate on hematuria and/or proteinuria in children［J］.Pediatr Nephrol，2004，19(3):313-316.

［3］ Setsuro F，Yoshiaki U，Tsuyoshi W，et al.Guanidinobenzoic acid derivatives:US，4021472［P］.1977-05-03.

［4］ Sugano Hideki.New production method of camostat mesylate:JP，9309873［P］.1997-12-02.

［5］ 王曉天，張建賓，金汝城.對胍基苯甲酸鹽酸鹽的制備及衍生物卡莫他特甲磺酸鹽的合成［J］. 精細化工，2004，21(8):597-599.