“活性”/可控自由基聚合在蛋白質雜化體制備中的應用研究進展

趙偉剛，鹿振武，逯盛芳，何乃普

(蘭州交通大學 功能高分子研究所，甘肅 蘭州 730700)

蛋白質-高分子聚合物的耦合物被廣泛應用在醫藥、生物技術和納米技術中。聚合物以共價鍵結合到蛋白質上，可提高蛋白質的穩定性，溶解性和生物相容性。此外，給合成聚合物賦予新的屬性，如自組裝和相位行為［1-3］。

基于修飾蛋白質賴氨酸側鏈的蛋白質-高分子結合體，例如蛋白質-聚乙二醇(PEG)結合體，被廣泛應用于臨床醫療，生物親和力分離，微蛋白分析和捕獲，分子傳感器，以及作為交換器來控制蛋白質活性等［4-8］。該聚合物在通常情況下是可溶于水的［4］，當受到外部刺激，例如光照、溫度和pH 值，能夠發生構象變化從而實現相分離。附著的聚乙二醇(PEG)蛋白質或肽的結合物在醫療上的應用，被稱為聚乙二醇化，是一個應用非常成功的例子，其產生了幾個好處包括增加的生物利用度和血漿半衰期，降低免疫原性，減少蛋白水解，增強溶解性和穩定性［9］。

“活性”/可控自由基聚合(LRP)技術是分子設計的重要途徑［10-15］，在制備窄的分子量分布(MWD)聚合物，分子量(MW)符合理論計算值的聚合物，以及各種嵌段共聚物和復雜大分子結構等方面有廣泛應用。“活性”/可控自由基聚合反應制備聚合物-蛋白質生物結合體的研究領域主要集中在利用引發轉移終止劑法(Iniferter)、氮氧自由基聚合(NMP)、原子轉移自由基聚合(ATRP)和可逆加成-斷裂鏈轉移活性自由基聚合(RAFT)4 種“活性”/可控自由基聚合體系來合成聚合物-蛋白質生物結合體［9］，以及對生物結合體共價鍵連接方式及所需的官能性引發劑的研究。

1 “活性”/可控自由基聚合物接枝蛋白質

“活性”/可控自由基聚合結合了活性聚合與自由基聚合的各種優勢，美國科學家Szwarc［16-18］在1956 年提出了活性聚合的概念，自從有了“活性”/可控自由基聚合后，高分子領域得到了突飛猛進的發展，因為“活性”/可控自由基聚合與傳統自由基聚合相比，具有無終止、無轉移、引發速率遠遠大于鏈增長速率等特點，能更好地實現對分子結構的控制，是實現分子設計、合成具有特定結構和性能聚合物的重要手段。但離子型活性聚合反應條件比較苛刻、適用單體較少，且只能在非水介質中進行，導致工業化成本居高不下，難以廣泛用于工業化。鑒于活性聚合和自由基聚合各自的優缺點，高分子合成化學家們聯想到將二者結合，即“活性”/可控自由基聚合［19-20］。目前，將“活性”/可控自由基聚合應用到蛋白質結合物的研究很多，已成為醫學界與高分子界交叉的熱門研究。

1.1 Iniferter 在蛋白質-高分子結合體制備中的應用

引發轉移終止劑法(Iniferter)是指那些同時集引發劑、轉移劑和終止劑作用于一身的物質［21］。1982 年Otus 發現Iniferter 以來，其文獻報道較少，其分類很多，按其引發類型主要分為光引發和熱引發兩類，據相關文獻報道［22］其光引發Iniferter 比熱引發Iniferter 更有效。引發轉移終止劑引發的活性自由基聚合機理是，當體系中穩定存在的自由基的濃度遠大于鏈自由基的濃度時，促使平衡正向移動，形成的休眠種大幅度降低鏈自由基的濃度，以減少鏈終止反應。Iniferter“活性”自由基聚合的特點是聚合產物的分子量隨聚合時間的增加而增大，分子量隨單體轉化率的增大而增大;當轉化率不大于40%時，聚合反應的轉化率和分子量隨反應時間成較好的線性關系，但分子量分布可控性不好，分子量分布(PDI)一般在2.0 左右［23］。目前已經合成了許多結構新穎的引發轉移終止劑，并將其用于制備端基功能化聚合物、遙爪聚合［24］、大分子單體［25-26］、嵌段和接枝共聚物［27］等。近十年來，這類研究在基因轉導劑、藥物載體等領域得到了迅速發展［28］。

Wootthikanokkhan J［28］用N，N-二乙基二硫代氨基甲酸芐酯(BDC)為引發劑，先聚合異戊二烯單體;以此為巨型引發劑與MMA 光聚合制備了線型PI/PMMA 兩嵌段共聚物［29］;以自合成的1，3，5-(N，N-二甲基二硫代氨基甲酸)-2，4，6-均苯三甲基芐酯為多臂引發劑，合成了星型二嵌段共聚物PI/PMMA，PI/PS 和星型三嵌段共聚物PI/PMM/PS。合成的星型多嵌段共聚物通過引入生物活性基團或環境友好單體可以用作潛在藥物載體。Miyamoto等［30-31］首先也用N，N-二乙基二硫代氨基甲酸芐酯(BDC)為光引發劑，聚合單體2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿(MPC)，在N，N-二環己基碳酰亞胺(DCC)存在的條件下，合成了末端帶有羧基的MPC的共聚物PMPC-COOH(如圖1 所示)而將木瓜蛋白酶固定在PMPC-COOH 上。對比實驗發現:未結合的木瓜酶在一周內失去活性，用PEO 鍵合的木瓜蛋白酶的活性一周后降低50%，而用PMPC-COOH 修飾的木瓜蛋白酶的活性4 周后無降低。所以，可以通過控制PMPC-COOH 的摩爾質量和對酶的修飾程度來穩定酶的活性，得到具有良好生物相容性的蛋白質-高分子結合體。Ishihara 等［31-32］用光引發聚合的PMPC 接枝得到水溶性纖維素MGC，用MGC 修飾的中空纖維微透析探頭(mi-crodialysis probe)長期植入體內不會引發明顯的炎癥反應，表現出良好的生物相容性和穩定性。Bai 等［31，33］將具有高靈敏度的電化學發光物質固定在光引發聚合的PMPC 材料上，動物實驗表明這種發光裝置具有良好的抗生物污染性能，可以用于研制各種與生物監測有關的傳感器。

圖1 PMPC 的Iniferter 活性聚合Fig.1 PMPC’s Iniferter living polymerization

1.2 NMP 在蛋白質-高分子結合體制備中的應用

NMP 活性自由基聚合屬于非催化性體系，是利用氮氧穩定自由基來控制自由基聚合［34］。其機理是利用氮氧自由基與鏈增長自由基之間的結合和可逆分解來實現單體的活性可控聚合，NMP 典型的引發劑是2，2，6，6-四甲基哌啶氮氧自由基(TEMPO)，TEMPO 作為穩定自由基，只與增長自由基發生偶合形成共價鍵，而這種共價鍵在高溫條件下又可以分解產生增長自由基和穩定自由基，通過這種可逆的鏈終止反應實現了單體(M)的活性自由基聚合。

Rutger 等［35-37］利用N-羧酸酐(NCA)開環后形成一個雙頭引發劑，運用NMP 法聚合成多肽-聚合物結合物，其反應如圖2 所示。研究表明，在利用這種合成方法合成由多肽組成的嵌段共聚物的過程中，每個鏈段中多肽的化學計量和區域選擇性是可控的。

圖2 通過NCA 聚合生物聚合物的NMP 聚合形成多肽嵌段共聚物Fig.2 A block copolymer was obtained by polymerization of NCA polypeptide biopolymers polymerized to form NMP

Chenal 等［38］利用帶有N-羥基琥珀酰亞胺基團的鏈段(SG1)的烷氧基胺為引發劑，實現了聚甲基丙烯酸乙二醇甲基醚酯(MePEGMA)的NMP 聚合，得到了一種基于氮氧SG1α-功能化的帶有聚乙二醇側鏈的梳狀聚甲基丙烯酸酯的聚乙二醇化聚合物。另外，以溶菌酶作為模型蛋白與其結合，進一步證明了上述合成路徑的高效性。NMP 在活性聚合反應中雖然分子量控制很好，可是其反應溫度較高，合成過程較復雜，產率低，并且氮氧自由基的價格昂貴等這些因素限制了NMP 活性自由基聚合的廣泛研究。

1.3 ATRP 在蛋白質-高分子結合體制備中的應用

ATRP 法是1995 年由王錦山和Matyjaszewski［39-41］發現的。ATRP 聚合反應以過渡金屬作為催化劑，使鹵原子實現可逆轉移，包括鹵原子從烷基鹵化物到過渡金屬絡合物(鹽)，再從過渡金屬絡合物(鹽)轉移至自由基的反復循環的原子轉移過程，伴隨著自由基活性(增長鏈自由基)種和大分子有機鹵化物休眠種之間的可逆轉換平衡反應，從而控制自由基活性種保持較低的濃度，減少了增長鏈自由基之間的不可逆雙分子終止副反應，使聚合反應得到有效的控制。但其缺點就是后處理比較繁瑣，不易從產物中提取出Cu 離子。

ATRP 自發現以來，由于其反應條件溫和，在室溫，水溶劑中可反應，所以這方面的聚合物和蛋白質結合體的研究大量而詳盡。ATRP 聚合制備生物蛋白質或肽結合物時，需要聚合物末端(或中間)鏈上有一個能與蛋白質上的胺基(─NH2)或巰基(─SH)特異性結合的功能性官能團。而這些功能基團是通過使用一些含這些功能基團的引發劑/轉移劑來接枝到聚合物末端(或中間)的。在ATRP 中具有功能性基團的引發劑主要有以下圖3 所示的這些。

圖3 ATRP 中具有功能性的基團的引發劑［37］Fig.3 The functional initiator groups of ATRP［37］

1.3.1 與蛋白質胺基相接形成聚合物-蛋白質結合體 Haddleton 等研究組［42］利用N-羥基琥珀酰胺引發劑(A1，A2，圖3)引發單體聚乙烯基乙二醇甲基醚(PEGMA)的ATRP 聚合，而后將聚合物PEGMA以共價鍵接枝到蛋白質上，如圖4 所示，并通過SDS-PAGE 電泳分析得知，每個蛋白質上大約共軛了6 ～7 個高分子鏈。

圖4 ATRP 聚合物的N-羥基琥珀酰胺與蛋白質的胺基偶聯Fig.4 The polymer of ATRP amine of N-hydroxysuccinimide and protein coupling

Haddleton 等研究組［43-44］又利用一個縮酮保護醛基的引發劑(A3，圖3)，通過ATRP 的方法實現了PEGMA 的聚合，然后又在酸性條件下(pH=5 或6)將聚合物端基的縮酮水解掉，從而得到端基醛，而此端基醛又能和蛋白質的胺基發生偶聯，從而實現了聚合物-蛋白質的結合，如圖5 所示。

圖5 ATRP 聚合物的醛基與蛋白質的胺基偶聯Fig.5 The polymer of ATRP of aldehyde and protein coupling

Hui Jiang 等［45］先通過ATRP 制得含有羧基的聚丙烯酸聚合物刷，而─COOH 在中性的pH 值和室溫條件下可以很容易地與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)反應形成琥珀酰亞胺酯，琥珀酰亞胺酯和蛋白質的胺基耦合形成蛋白質-聚合物刷。

1.3.2 與蛋白質巰基相接形成聚合物-蛋白質結合體在與蛋白質巰基相接的這種蛋白質-高分子結合體在制備過程中，通常會用到馬來酰亞胺作為ATRP 引發劑，但是不能直接用帶有馬來酰亞胺基團的ATRP 引發劑引發聚合單體，因為直接使用會同時引發馬來酰亞胺中可聚合部分發生聚合作用使其失去接枝蛋白質巰基的活性。所以通常在這種反應中有兩種設計方案:①高聚物接枝蛋白質(“grafting to”)法［46-48］:用叔丁氧羰保護的帶有氨基的引發劑(A8，圖3)先與單體發生ATRP 聚合，其聚合物中叔丁氧羰保護的氨基再與3-馬來酰亞胺丙酰氯在N，N-二異丙基乙基胺的存在下通過酰胺化反應引入馬來酰亞胺部分，或用呋喃保護的帶有馬來酰亞胺基團的引發劑(A9，圖3)先與單體發生ATRP 聚合，然后去除呋喃的保護獲得馬來酰亞胺部分，再與蛋白質巰基耦合相接。②蛋白質引發劑引發ATRP聚合(“grafting from”)法［49-50］:先利用蛋白質巰基與馬來酰亞胺引發劑反應，生成蛋白質引發劑，再進行ATRP 反應，其反應機理見圖6。

圖6 “grafting to”和“grafting from”的反應機理Fig.6 The reaction mechanisms of“grafting to”and“grafting from”

Kelly Velonia 等［46］利用呋喃保護的馬來酰亞胺引發劑(A9，圖3)通過ATRP 聚合形成端基帶有呋喃保護的馬來酰亞胺的聚合物，反應掉呋喃的保護，得到端基帶有馬來酰亞胺的聚合物，再與蛋白質巰基通過共價鍵耦合，形成蛋白質-高分子的結合物，接著通過“點擊”化學(“click”)在蛋白質-聚合物的結合物上形成1，2，3-三唑。反應見圖7。

圖7 “grafting to”的ATRP 聚合物偶聯蛋白質巰基Fig.7 The polymer by ATRP and the thiol group of protein was conjugated by“grafting to”

Maynard 等［50］利用馬來酰亞胺先通過與蛋白質巰基偶聯接枝到蛋白質上形成蛋白質引發劑，隨后利用蛋白質引發劑引發單體N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)進行ATRP 聚合，從而生成蛋白質-高分子的結合體，見圖8。以蛋白質作為引發劑合成聚合物-高分子生物結合體的最大的優點是不需要多步反應就能實現蛋白質與聚合物結合。

1.4 RAFT 在蛋白質雜化體制備中的應用

1998 年Rizzardo 等［51-53］將雙硫酯類衍生物加入到傳統的自由基體系中，通過鏈段的加成和斷裂動態平衡實現活性可控的［54-55］。

近年來，RAFT 的研究比較成熟，發展迅速，通常采用單官能度、雙官能度和多官能度的雙硫代酯類化合物作鏈轉移劑，從而成功地制備了嵌段［56］，接枝［57］，星型［58］高聚物。由于RAFT 聚合反應條件溫和，后處理簡單，產物的分子量分布較窄，并可合成復雜結構的聚合物。近年來特別是利用RAFT活性聚合制備蛋白質雜化體結合物成為科學研究的一個廣闊領域。但其所用鏈轉移劑雙硫酯的制備過程相對復雜的缺點使這一反應略慢于ATRP 活性聚合的研究。在RAFT 活性聚合中引發聚合反應又與蛋白質耦合接枝的官能化的引發劑見圖9，這些引發劑都是與蛋白質的巰基以共價鍵耦合相接。

圖8 “grafting from”的ATRP 聚合物偶聯蛋白質巰基Fig.8 The conjugate polymer and the thiol group of protein by“grafting from”ATRP

圖9 RAFT 中具有功能性的基團的引發劑［37］Fig.9 The functional initiator groups of RAFT

圖10 利用“grafting to”法的RAFT 聚合物接枝蛋白質Fig.10 Grafted the polymer to protein by RAFT“grafting to”

1.4.1 “grafting to”的RAFT 聚合物-蛋白質結合體

Davis 等［59-60］研究組以吡啶二硫化RAFT 的引發劑(R11，圖9)引發單體N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)進行RAFT 活性聚合，形成聚合物P(HPMA)，但在此聚合物中它不同于ATRP 聚合所生成的聚合物的是它的接枝蛋白質的官能化的吡啶二硫基團在此聚合物的中間，見圖10。

1.4.2 “grafting from”的RAFT 聚合物-蛋白質結合體 Sumerlin 等［61］運用帶有馬來酰亞胺基團的RAFT 引發劑先與牛血清白蛋白(BSA)的巰基以共價鍵相耦合形成蛋白質的RAFT 引發劑(R13，圖9)，接著引發RAFT 活性聚合單體N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)聚合生成蛋白質高分子結合體，見圖11。

圖11 利用“grafting from”法的RAFT 聚合物接枝蛋白質Fig.11 Grafted the polymer to protein by RAFT“grafting from”

2 結論

“活性”/可控自由基聚合技術集自由基聚合與活性聚合的優點于一體，能夠設計制備符合理論計算值的分子量(MW)和窄的分子量分布(MWD)的聚合物，這一優點使得“活性”/可控自由基聚合被廣泛應用在高分子化合物和生物高分子材料等領域。近年來，特別是對ATRP 和RAFT 這兩種“活性”/可控自由基聚合的研究相對較多。ATRP 反應條件簡單，制備容易，但是由于產物中除去催化劑銅離子較困難，所以這方面的研究朝著無銅化且具有生物相容性催化劑的方向發展。RAFT 雖然反應條件溫和且產物處理簡單，但是RAFT 的二硫引發劑的制備困難成為它致命的缺點，所以RAFT 引發劑制備的研究有待發展。

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