胎兒染色體非整倍體產(chǎn)前篩查進(jìn)展

黃賽瓊，宋亦軍，劉俊濤

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100730）

過去30年里，胎兒染色體非整倍體產(chǎn)前篩查從單純的孕婦年齡篩查到不同模式的母血清學(xué)篩查，檢出率和準(zhǔn)確度均逐漸提高。最近，隨著基因測(cè)序和生物信息領(lǐng)域的進(jìn)展，出現(xiàn)了檢出率和準(zhǔn)確度近似于產(chǎn)前診斷的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)方法（noninvasive prenatal testing，NIPT）。認(rèn)識(shí)胎兒非整倍體檢測(cè)的歷史進(jìn)展和近幾十年分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的進(jìn)步，能更好地理解NIPT 及這一新方法在分子水平的應(yīng)用前景。

一、傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查進(jìn)展

1984年，Markatz 等［1］發(fā)現(xiàn)母血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）降低與胎兒21三體、18三體等常染色體異常相關(guān)。同年Cuckle等［2］證實(shí)結(jié)合年齡和中孕期母血清AFP 的產(chǎn)前篩查方法對(duì)唐氏 綜 合 征（Down’s syndrome，DS）的 檢 出 率 為40%，假陽性率5%。之后Bogart等［3］報(bào)道孕育DS胎兒孕婦中孕期血清人絨毛膜促性腺激素β（human chorionic gonadotropinβ，βHCG）水平升高，非結(jié)合雌激素（unconjugated estriol，uE3）水平降低。1988年，Wald等［4］首先提出聯(lián)合中孕期血清指標(biāo)βHCG、AFP、uE3和孕婦年齡的篩查模式，將DS檢出率提高到61%。胎兒非整倍體篩查進(jìn)入多項(xiàng)孕婦血清標(biāo)志物聯(lián)合篩查的新紀(jì)元，并先后提出了中孕期篩查、早孕期篩查、早中孕期聯(lián)合篩查的模式。

1.中孕期血清學(xué)篩查：中孕期血清學(xué)篩查包括二聯(lián)（AFP＋βHCG）篩查、三聯(lián)（AFP＋βHCG＋uE3）篩查、四聯(lián)［AFP＋βHCG＋uE3＋I(xiàn)nh A（inhibin A））篩查。血清尿超聲篩查研究（the serum，urine and ultrasound screening study，SURUSS）采用前瞻性多中心方法，納入47 053例孕14～20周妊娠婦女，其中包括101例DS胎兒，以1：300為危險(xiǎn)切割值進(jìn)行篩查。研究結(jié)果顯示，假陽性率為5%時(shí)，二聯(lián)、三聯(lián)、四聯(lián)篩查DS 檢出率分別為71%、77%、81%［5］。

目前臨床中，中孕期血清學(xué)篩查指標(biāo)也用于18三體的篩查。T18 胎兒母血清AFP、uE3和HCG 水平均降低：AFP≤0.75MoM（中位數(shù)倍數(shù)），HCG≤0.60MoM 和E3≤0.55MoM。Canick 等［6］采用固定切割值的計(jì)算方法，中孕期三聯(lián)篩查模式可檢出60%的T18胎兒，假陽性率0.4%。由于孕婦年齡和常染色體三體的發(fā)病率相關(guān)性不確切，不能合并到T18風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，Palomaki等［7］通過似然比校正年齡風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算每個(gè)孕婦孕育T18胎兒的風(fēng)險(xiǎn)，設(shè)定切割值為1：100時(shí)，T18檢出率60%，假陽性率0.2%。事實(shí)上，兩種方法的檢出率和假陽性率變化比理論上變化還大。T18胎兒母血清Inh A水平比正常胎兒母血清約低25%［8］，但相關(guān)文獻(xiàn)較少。

另外，中孕期血清學(xué)篩查DS、T18高風(fēng)險(xiǎn)的部分胎兒染色體核型可能提示45，XO，以及性染色體三倍體等。目前有研究證實(shí)伴水腫或水囊瘤45，XO 胎兒的母血清AFP、uE3水平降低，βHCG 水平升高，不伴水腫的45，XO 胎兒母血清HCG 和inhibin A 水平降低［9-10］；這與T21、T18 高危孕婦血清學(xué)變化相似。三倍體胎兒孕婦血清βHCG 水平可明顯升高或降低，uE3水平降低，AFP 水平可升高或降低［10］。

血清學(xué)篩查結(jié)果受多胎妊娠，孕周不準(zhǔn)確，或雙胎之一胚胎停育影響。中孕期血清學(xué)篩查局限性是孕婦必須等到15 周后才可進(jìn)行，故得知胎兒DS、T18異常的風(fēng)險(xiǎn)后無法進(jìn)行早期干預(yù)。為了更早發(fā)現(xiàn)及干預(yù)DS、T18高風(fēng)險(xiǎn)胎兒，國(guó)際血清學(xué)篩查研究轉(zhuǎn)向早孕期篩查。

2.早孕期血清學(xué)篩查：早孕期血清學(xué)篩查指標(biāo)包括妊娠相關(guān)血漿蛋白A（pregnancy-associated plasma protein A，PAPP-A）和βHCG。早孕期DS胎兒母血清PAPP-A 水平降低，βHCG 水平升高；T18胎兒母血清PAPP-A 和β HCG 水平均降低。Brambati等［11］首先提出聯(lián)合β HCG、PAPP-A 和孕婦年齡進(jìn)行早孕期血清學(xué)篩查，孕8～12 周DS檢出 率78.9%。Noble 等［12］發(fā) 現(xiàn) 早 孕 期 血 清β HCG 和胎兒頸項(xiàng)透明層（nuchal translucency，NT）是DS篩查的獨(dú)立指標(biāo)，將NT 引入早孕期血清篩查。NT 聯(lián)合βHCG 的早孕期篩查模式的DS檢出率85%，假陽性率5%。兩年后有研究提出聯(lián)合β HCG、PAPP-A、NT 和孕婦年齡的早孕期聯(lián)合篩查模式。Wapner等［13］對(duì)8 514例10＋4～13＋6周孕婦進(jìn)行多中心早孕期聯(lián)合篩查，DS檢出率78.7%，假陽性率5%，T18 檢出率90.9%，假陽性率2%，證實(shí)早孕期聯(lián)合篩查可用于臨床。另外，多項(xiàng)前瞻性研究［5，13-15］發(fā)現(xiàn)假陽性率為5%時(shí)，早孕期聯(lián)合篩查DS 檢出率78.7%～85%，較中孕期檢出率高。Avgidou等［14］前瞻性研究報(bào)道孕11～13＋6周的早孕期聯(lián)合篩查假陽性率7.5%時(shí)，可檢出92.3%T18，88.9%T13，84.2%45，X 和86.1%其它染色體異常。

早孕期篩查最主要的優(yōu)勢(shì)是早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)，早期終止妊娠相對(duì)于中期引產(chǎn)更安全；還可以減少孕婦及家屬的焦慮。但是部分早孕期篩查提示的DS胎兒在中孕期篩查前自然流產(chǎn)，因此可能增加了不必要的人工流產(chǎn)術(shù)。絨毛染色體核型分析可能出現(xiàn)嵌合體，需要等到中孕期羊膜腔穿刺才確診是否為限制性胎盤染色體嵌合。此外，NT 篩查的準(zhǔn)確性受胎位、醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)等多種因素的影響，NT 的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性較血清學(xué)指標(biāo)差［16］。

3.早中孕期聯(lián)合篩查：早中孕期聯(lián)合篩查模式的檢出率均較單純?cè)缭衅诨蛑性衅诤Y查高。早中孕期聯(lián)合篩查模式包括序貫篩查（sequential screening，SS）、整合篩查（integrated screening，IS）、酌情篩查（contingency screening，CS），詳見表1和表2。Malone等［17］的研究發(fā)現(xiàn)CS是最佳的早中孕期聯(lián)合篩查模式；當(dāng)CS假陽性率為4.3%時(shí)，DS檢出率為93%；CS 早孕期DS 檢出率為65.1%（1.5%孕婦需進(jìn)行絨毛活檢）；CS 中孕期DS 檢出率為27.9%（2.8%孕婦需進(jìn)行羊膜腔穿刺）。

臨床實(shí)踐中，不同類型的早中孕期聯(lián)合篩查模式各有優(yōu)缺點(diǎn)。獨(dú)立序貫篩查分別報(bào)告篩查結(jié)果，Malone等［15］報(bào)道其假陽性率11%和檢出率94%，均較高，準(zhǔn)確性降低，故不推薦使用。階段序貫篩查假陽性率4.9%低于獨(dú)立序貫篩查［17］，但早孕期低危孕婦由于費(fèi)用等原因可能選擇終止篩查。完全整合篩查假陽性率4.0%較階段序貫篩查更低［15］，但孕婦均需等到中孕期得知篩查結(jié)果；大多數(shù)早孕期低危患者不能從中孕期篩查獲益；早孕期高危孕婦不能早期診斷、早期干預(yù)。一方面，NT 的測(cè)量準(zhǔn)確度依賴于超聲科醫(yī)師的技術(shù)水平；另一方面，相同假陽性率情況下整合血清學(xué)篩查檢出率低于完全整合篩查，高于早孕期篩查、中孕期篩查。NT 測(cè)量水平有限的單位，可以選擇整合血清學(xué)篩查方法。酌情篩查是效價(jià)比最高的模式［17］，但是對(duì)于絨毛活檢（CVS）不成熟的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，整合篩查是最佳選擇。

二、NIPT 在產(chǎn)前篩查領(lǐng)域的研究進(jìn)展

1.NIPT 的發(fā)現(xiàn)及臨床應(yīng)用：1997年，Lo等［18］通過聚合酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增得到母體外周血中Y染色體的特異性DNA 序列，從而證明懷有男性胎兒的母血漿中存在胎兒游離DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）。cffDNA 幾乎全部來源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，DNA 片段相當(dāng)小，約150bp。最早可孕5周在母血漿內(nèi)測(cè)到cffDNA，孕7周胎兒胎盤循環(huán)建立后，cffDNA 即以一定的比例穩(wěn)定存在于母體外周血中，并隨著孕周的增大而增多，約5%～30%。游離DNA 半衰期僅為16.3 min，分娩2h后母血中的cffDNA 即完全降解。早在2006年，有研究報(bào)道可用等位基因比方法從母體血漿檢測(cè)胎兒染色體非整倍體。此后，出現(xiàn)了許多基于DNA、RNA 等位基因的不同方法。同樣也出現(xiàn)了多種分析方法如數(shù)字PCR、質(zhì)譜分析法。但由于這些技術(shù)均存在局限性而未能廣泛應(yīng)用。2008 年，Chiu等［19］首次報(bào)道用大規(guī)模平 行測(cè)序（massively parallel sequencing，MPS）技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)胎兒非整倍體，使cff DNA大規(guī)模用于臨床產(chǎn)前檢測(cè)。2011 年首個(gè)獨(dú)立的多中心NIPT 臨床研究［20］采用盲法驗(yàn)證，病例對(duì)照方法，從27個(gè)中心入組4 600多例胎兒非整倍體高危的孕婦（高齡，血清學(xué)篩查陽性，超聲結(jié)果提示非整倍體，個(gè)人或家族非整倍體史，家族羅伯遜易位）。未經(jīng)校正的測(cè)序數(shù)據(jù)顯示DS檢測(cè)率98.6%（209／212），假 陽 性率0.20%（2／1 471）。應(yīng) 用 腺 苷 標(biāo) 準(zhǔn) 化 修 正（a correction for GC normalization and repeat masking）后，DS的靈敏度99.1%（210／212），特異性99.9%。同時(shí)該報(bào)道評(píng)估了使用MPS 進(jìn)行DS 無創(chuàng)檢測(cè)的測(cè)試性能，0.8%樣 本 測(cè) 試 失 敗。隨 后 多 項(xiàng) 研 究［21-23］證 實(shí)NIPT 用 于21 三 體、18 三 體、13 三 體 產(chǎn) 前 篩 查 有良好的臨床有效性（表3）。

表1 早中孕期聯(lián)合篩查模式分類［15，17］

表2 不同早中孕聯(lián)合篩查模式篩查效率比較［17］（%）

表3 T21、T18、T13的NIPT 篩查效率

另外，部分研究組用目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增測(cè)序法檢測(cè)目標(biāo)染色體（12、18、13、X、Y）。根據(jù)是否基于單核苷 酸 多 態(tài) 性（single nucleotide polymorphism，SNP），目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增測(cè)序法被分為兩類。Norton等［24］進(jìn)行前瞻性多中心隊(duì)列研究并證實(shí)用DANSR（digital analysis of selected regions）方 法 和FORTE（fetal-fraction optimized risk of trisomy evaluation）方法進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，DS檢測(cè)靈敏度和特異度分別為100%和99.97%，T18檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為97.4%和99.93%。另一類基于SNP的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增法是通過多重PCR 技術(shù)擴(kuò)增13、18、21、X 和Y 染色體上的SNP 位點(diǎn)后高通量測(cè)序擴(kuò)增片段來獲得母體和胎兒的基因型及等位基因頻率信息。Zimmermann 等［25］用這種目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增法檢測(cè)166例樣本，檢出全部非整倍體病例（包括2例T13，3例T18，11例T21，2例45，XO，2例47，XXY）。它潛在的優(yōu)勢(shì)是能減少大量無用信息，提高檢測(cè)的效率及靈敏度。但目前尚無大規(guī)模臨床研究結(jié)果。由于當(dāng)時(shí)已經(jīng)發(fā)表的研究?jī)H限于非整倍體高危人群，所以2012年國(guó)際產(chǎn)前診斷學(xué)會(huì)（International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD），美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)（The American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）與美國(guó)母胎醫(yī)學(xué)會(huì)（The Society for Maternal-Fetal Medicine，SMFM），中國(guó)產(chǎn)前診斷技術(shù)專家組均只建議T21、T18、T13高危孕婦進(jìn)行NIPT 檢測(cè)［26-28］。但之后Song等［29］和Faibrother等［30］研究分別比較了低齡人群中孕期血清學(xué)篩查，早孕期聯(lián)合篩查與NIPT的篩查效率，均證實(shí)NIPT 的假陽性率更低，可明顯減少侵入性產(chǎn)前診斷，同時(shí)減少操作相關(guān)的不良后果?？紤]到NIPT 昂貴的篩查費(fèi)用，美國(guó)把NIPT作為二線篩查方案用于早孕期或中孕期篩查陽性孕婦，但這種篩查模式不能改善假陰性率，可能漏診10%～15%DS［31］。邊旭明［32］在國(guó)內(nèi)外臨床專家討論的基礎(chǔ)上，總結(jié)了NIPT 在產(chǎn)前篩查／產(chǎn)前診斷體系里5種可能的模式供選擇。（表4）。

表4 無創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測(cè)的幾種不同臨床路徑［32］

2.NIPT 的局限性及相關(guān)研究：NIPT 的局限性包括：（1）目前篩查目標(biāo)疾病僅針對(duì)21 三體、18三體、13三體；（2）以下因素均可以通過cff DNA濃度影響NIPT 結(jié)果的準(zhǔn)確性：孕婦體重、孕周、非整倍體類型、多胎妊娠、嵌合體；（3）限制性胎盤嵌合體、孕婦本人嵌合體、雙胎之一胎死宮內(nèi)或胚胎停育，或者孕婦本人患惡性腫瘤疾病等均可影響NIPT 陽性結(jié)果與染色體核型的一致性。針對(duì)NIPT 的局限性，一些研究分析了可能的原因，并報(bào)道了與其相關(guān)的新進(jìn)展。

關(guān)于孕婦體重指數(shù)肥胖孕婦cff DNA 濃度降低，可能與增加的循環(huán)血量稀釋cff DNA 有關(guān)［33］；游離DNA 總量隨體重指數(shù)按比例增加，而cff DNA不增加，即相當(dāng)于cff DNA 濃度降低［34］。

關(guān)于胎兒非整倍體類型與染色體核型正常胎兒游離DNA 比較，T21 胎兒游離DNA 濃度增加，T18、T13、45，XO 則減少［35］。

關(guān)于多胎妊娠NIPT 檢出所有非整倍體胎兒，DS中位Z值為12.3［36］，如果雙胎染色體核型一致則非整倍體Z值應(yīng)該與cff DNA 呈線性相關(guān)，處理方法同單胎妊娠；因?yàn)閏ff DNA 含量不是翻倍，如果雙胎非整部體核型不一致，則多胎妊娠每個(gè)胎兒的游離DNA 濃度減少，其中大約10%～15%病例游離DNA 濃度低于4%，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，香港中文大學(xué)研究組通過專有算法識(shí)別孕婦和胎兒序列不同的基因區(qū)域［37］來快速確認(rèn)雙合子雙胎，并進(jìn)一步計(jì)算評(píng)估雙合子雙胎的每個(gè)胎兒的游離DNA 濃度是否足夠［38］。

關(guān)于性染色體起初MPS檢測(cè)常染色體非整倍體胎兒的研究發(fā)現(xiàn)性染色體非整部體的檢出率較低［21］。這可能與X 染色體GC 含量導(dǎo)致的測(cè)序偏移，X、Y 染色體標(biāo)記序列相似，Y 染色體偏小，孕婦或胎兒嵌合體有關(guān)［39］。采用染色體核型和NIPT同時(shí)檢測(cè)試驗(yàn)?zāi)０逯械? 546例樣本的性染色體異常，總敏感度100%（95%CI 82.3%～100%），假陽性率0.1%（95%CI 0%～0.3%），失敗率6%（95%CI4.9%～7.4%）。在單盲試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，這種方法的敏感度96.2%（95%CI 78.4%～99.8%），假陽性率0.3%（95%CI 0%～1.8%），檢測(cè)失敗率5%（95%CI 3.2%～7.7%）。191 例染色體核型為女性的樣本中MSP檢測(cè)結(jié)果4例男性，1例45X 假陽性，1例45X 假陰性，185例檢測(cè)準(zhǔn)確（167例XX，17例XO，1例XXX），199例男性樣本中1例檢測(cè)為女性，其他樣本NIPT 結(jié)果與染色體核型一致為（191例XY，5 例XXY，2 例XYY）。Guex等［40］用改良的方法處理性染色體GC 序列偏移；有文獻(xiàn)［41］報(bào)道，用SNP 分析性染色體避開X 染色體的生物學(xué)特性來改善NIPT 性染色非整倍體檢出率。

3.NIPT 的展望：在相當(dāng)短的時(shí)間里，已經(jīng)利用cff DNA 進(jìn)行NIPT 測(cè)試，并應(yīng)用于常見胎兒染色體非整倍體檢測(cè)。未來NIPT 的臨床應(yīng)用進(jìn)展最可能延伸至胎兒亞顯微染色體異常［31］。Peters等［42］證實(shí)，可以通過母體血漿游離DNA 檢測(cè)胎兒染色體微缺失如22q11.2，也稱DiGeorge 綜合征。Lo等［43］構(gòu)建的基因組水平檢測(cè)染色體復(fù)制數(shù)量異常的框架證明，染色體微缺失或微重復(fù)檢測(cè)不需要基因分析方法的根本變化，只需要新的測(cè)序數(shù)據(jù)計(jì)算函數(shù)。雖然cffDNA 檢測(cè)染色體微缺失、微重復(fù)開始轉(zhuǎn)向臨床應(yīng)用，但它的廣泛應(yīng)用取決于測(cè)序深度和分析的費(fèi)用。另外，Lo等［44］證明可以通過母血漿內(nèi)的cff DNA 重建胎兒全基因。但利用cffDNA重建胎兒全基因方法的臨床應(yīng)用仍需要進(jìn)一步的研究。隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，無創(chuàng)胎兒染色體核型分析成本降低后也可能替代染色體核型分析。連續(xù)流式PCR（continuous-flow polymerase chain reaction，CF-PCR）芯片、熒光原位雜交（fluorescence in-situ hybridization，F(xiàn)ISH）和 微 陣 列 芯 片（microarrays）分析為目前應(yīng)用前景較好的方法。

［1］ Merkatz IR，Nitowsky HM，Macri JN，et al，An association between low maternal serum alpha-fetoprotein and fetal chromosomal abnormalities［J］.Am J Obstet Gynecol，1984，148：886-894.

［2］ Cuckle HS，Wald NJ，Lindenbaum RH.Maternal serum alpha-fetoprotein measurement：a screening testing for Down syndrome［J］.Lancet，1984，1：926-929.

［3］ Bogart MH，Pandian MR，Jones OW.Abnormal maternal serum chorionic gonadotropin levels in pregnancies with fetal chromosome abnormalities［J］.Prenat Diagn，1987，7：623-630.

［4］ Wald NJ，Cuckle HS，Densem JM，et al.Maternal serum screening for Down’s syndrome in early pregnancy［J］.BMJ，1988，297：883-887.

［5］ Wald NJ，Rodeck C，Hackshaw AK，et al.First and second trimester antenatal screening for Down’s syndrome：the results of the serum urine and ultrasound screening study（SURUSS）［J］.J Med Screen，2003，10：56-104.

［6］ Canick JA，Palomaki GE，Osthanondh R.Prenatal screening for trisomy 18in the second trimester［J］.Prenat Diagn，1990，10：546-548.

［7］ Palomaki GE，Knight GJ，Haddow JE，et al.Risk-based prenatal screening for trisomy 18 using alpha-fetoprotein，unconjugated oestriol and human chorionic gonadotropin［J］.Prenat Diagn，1995，15：713-723.

［8］ Wenstrom KD，Chu DC，Owen J，et al.Maternal serum AFP and dimeric inhibin-A detect aneuploidies other than Down syndrome［J］.Am J Obstet Gynecol，1998，179：966-970.

［9］ Lambert-Messerlian GM，Saller DN，Tumber MB，et al.Second trimester maternal serum inhibin A levels in fetal trisomy 18and Turner syndrome with and without hydrops［J］.Prenat Diagn，1998，18：1061-1067.

［10］ Saller DN，Canick JA，Schwartz S，et al.Multiple marker screening in pregnancies with hydropic and nonhydropic Turner syndrome［J］.Am J Obstet Gynecol，1992，167：1021-1024.

［11］ Brambati B，Tului L，Bonacchi I，et al.Serum PAPP-A and free beta-hCG are first-trimester screening markers for Down syndrome［J］.Prenat Diagn，1994，14：1043-1047.

［12］ Noble PL，Abraha HD，Snijders RJ，et al.Screening for fetal trisomy 21in the first trimester of pregnancy：maternal serum free beta-hCG and fetal nuchal translucency thickness［J］.Ultrasound Obstet Gynecol，1995，6：390-395.

［13］ Wapner R，Thom E，Simpson JL，et al.First trimester maternal serum biochemistry and fetal nuchal translucency screening（BUN）study group.First-trimester screening for trisomies 21and 18［J］.N Engl J Med，2003，349：1405-1413.

［14］ Avgidou K，Papageorghiou A，Bindra R，et al.Prospective first-trimester screening for trisomy 21in 30，564pregnancies［J］.Am J Obstet Gynecol，2005，192：1761-1767.

［15］ Malone FD，Canick JA，Ball RH，et al.First-trimester or second-trimester screening，or both，for Down’s syndrome［J］.N Engl J Med，2005，353：2001-2011.

［16］ Haddow JE，Palomaki GE，Knight GJ，et al.Screening of maternal serum for fetal Down’s syndrome in the first trimester［J］.N Engl Med，1998，338：955-961.

［17］ Malone FD，Cuckle H，Ball RH，et al.Contingent screening for trisomy 21results from a general population screening trial［J］.Am J Obstet Gynecol，2005，193：S29.

［18］ Lo YM，Crobetta N，Chamberlain PF，et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma serum［J］.Lancet，1997，350：485-487.

［19］ Chiu RW，Chan KCA，Gao Y，et al.Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma［J］.ProcNatl Acad Sci USA，2008，105：20458-20463.

［20］ Palomaki GE，Kloza EM，Lambert-Messerlian GM，et al.DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome：an international clinical validation study［J］.Genet Med，2011，13：913-920.

［21］ Bianchi DW，Platt LD，Goldberg JD，et al.Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing［J］.Obstet Gynecol，2012，119：890-901.

［22］ Lau TK，Chen F，Pan X，et al.Noninvasive prenatal diagnosis of common fetal chromosomal aneuploidies by maternal plasma DNA sequencing［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2012，25：1370-1374.

［23］ Palomaki GE，Deciu C，Kloza EM，et al.DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18and trisomy 13 as well as Down syndrome：an international collaborative study［J］.Genet Med，2012，14：296-305.

［24］ Norton ME，Brar H，Weiss J，et al.Noninvasive chromosomal evaluation（NICE）study：results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21and trisomy 18［J］.Am J Obstet Gynecol，2012，207：137.e1-8.

［25］ Zimmermann B，Hill M，Gemelos G，et al.Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13，18，21，X，and Y，using targeted sequencing of polymorphic loci［J］.Prenat Diagn，2012，32：1-9.

［26］ Benn P，Borrell A，Cuckle H，et al.Prenatal detection of down syndrome using massively parallel sequencing（mps）：a rapid response position statement from a committee on behalf of the board of the international society for prenatal diagnosis［J］.Prenat Diagn，2012，32：1-2.

［27］ ACOG.Committee opinion no.545：noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy［J］.Obstet Gynecol，2012，120：1532-1534.

［28］ 蔣宇林，朱宇寧，呂時(shí)銘，等.2012年產(chǎn)前分子診斷新技術(shù)專家座談會(huì)紀(jì)要［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2012，47：804-807.

［29］ Song Y，Liu C，Qi H，et al.Noninvasive prenatal testing of fetal aneuploidies by massively parallel sequencing in a prospective Chinese population［J］.Prenat Diagn，2013，33：700-706.

［30］ Faibrother G，Johnson S，Musci TJ，et al.Clinical experience of noninvasive prenatal testing with cell-free DNA for fetal trisomies 21，18，and 13，in a general screening population［J］.Prenat Diagn，2013，33：580-583.

［31］ Bianchi DW，Wikins-Haug L.Integration of noninvasive DNA testing for aneuploidy into prenatal care：what has happened since the rubber met the road？［J］.Clin Chem，2014，60：78-87.

［32］ 邊旭明.胎兒染色體非整倍體的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)［J］.實(shí)用婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2013，29：330-333.

［33］ Canick JA，Palomaki GE，Kloza EM，et al.The impact of maternal plasma DNA fetal fraction on next generation sequencing tests for common fetal aneuploidies［J］.Prenat Diagn，2013，33：667-674.

［34］ Vora NL，Johnson KL，Basu S，et al.A multifactorial relationship exists between total circulating cell-free DNA levels and maternal BMI［J］.Prenat Diagn，2012，32：912-914.

［35］ Ashoor G，Poon L，Syngelaki A，et al.Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11-13weeks’gestation：effect of maternal and fetal factors［J］.Fetal Diagn Ther，2012，31：237-243.

［36］ Canick JA，Kloza EM，Lambert-Messerlian GM，et al.DNA sequencing of maternal plasma to identify Down syndrome and other trisomies in multiple gestations［J］.Prenat Diagn，2012，32：730-734.

［37］ Jiang P，Chan KC，Liao GJ，et al.Fetal Quant：deducing fractional fetal DNA concentration from massively parallel sequencing of DNA in maternal plasma［J］.Bioinformatics，2012，28：2883-2890.

［38］ Leung TY，Qu JZ，Liao GJ，et al.Noninvasive twin zygosity assessment and aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing［J］.Prenat Diagn，2013，33：75-81.

［39］ Mazloom AR，Dzakula Z，Oeth P，et al.Noninvasive prenatal detection of sex chromosomal aneuploidies by sequencing circulating cell-free DNA from maternal plasma［J］.Prenat Diagn，2013，33：591-597.

［40］ Guex N，Iseli C，Syngelaki A，et al.A robust secondgeneration genome-wide test for fetal aneuploidy based on shotgun sequencing cell-free DNA in maternal blood［J］.Prenat Diagn，2013，33：707-710.

［41］ Samango-Sprouse C，Banjevic M，Ryan A，et al.SNP-based non-invasive prenatal testing detects sex chromosome aneuploidies with high accuracy［J］.Prenat Diagn，2013，33：643-649.

［42］ Peters D，Chu T，Yatsenko SA，et al.Noninvasive prenatal diagnosis of a fetal microdeletions syndrome［J］.N Engl J Med，2011，365：1847-1848.

［43］ Yu SC，Jiang P，Choy KW，et al.Noninvasive prenatal molecular karyotyping from maternal plasma［J／OL］.PLoS One，2013，8：e60968.

［44］ Lo YM，Chan KC，Sun H，et al.Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus［J］.Sci Transl Med，2010，2：61ra91.