β-葡聚糖酶產生菌的分離、篩選及鑒定

王 偉，王世英，郭曉軍，李 佳，朱寶成

（河北農業大學生命科學學院，河北保定071000）

β-葡聚糖作為植物細胞壁的結構性非淀粉多糖，廣泛存在于燕麥、大麥、黑麥、小麥等麥類作物中。常見麥類作物中，燕麥和大麥β-葡聚糖含量較高，其中燕麥含量最高。β-葡聚糖是限制麥類有效利用的主要因素，因此常使用β-葡聚糖酶來有效分解麥類植物胚乳細胞壁中的β-葡聚糖，以降低飼料中非淀粉多糖（NSP）及其抗營養因子的含量，從而提高飼料的消化率，促進禽畜的生長（劉雨田等，2000）。 翟曉莉（2012）研究表明，在大麥型豬飼糧中添加β-葡聚糖酶，會使日增重提高5%～45%，飼料報酬率提高3%～15%。李春燕等（2012）在肉雞飼料中分別添加0.1%和0.2%的β-葡聚糖酶，結果發現肉雞日增重提高了10.45%和15.31%，料肉比降低了9.64%和10.84%，差異均顯著。

本研究利用剛果紅平板法作為篩選模型，從動物糞便中分離和篩選高產β-葡聚糖酶的菌株，并對其進行形態、生理生化特征和16S rDNA基因序列同源性分析及系統發育分析，從而對其進行鑒定，為今后該菌株在畜牧生產中的應用提供良好基礎。

1 材料

1.1 供試樣品 動物糞便，取自河北農業大學動物標本園。

1.2 培養基 NA培養基、NB培養基的配制詳見《微生物學實驗技術》（程麗娟和薛泉宏，2000）。

分離和初篩培養基：β-葡聚糖 0.1 g，剛果紅0.04 g，蛋白胨 1.0 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.01 g，CaCl20.04 g，瓊脂 1.5 ～ 2.0 g，蒸餾水 100 mL，pH 7.0，121℃滅菌 20 min。

發酵產酶培養基：β-葡聚糖0.1 g，蛋白胨1.0 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.01 g，CaCl20.04 g， 蒸餾水100 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌 20 min。

1.3 生理生化鑒定 生理生化鑒定試劑參見《常見細菌系統鑒定手冊》東秀珠和蔡妙英（2001）。

1.4 DNA提取和16s rDNA基因擴增所用試劑TE 緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）；1 mmoL EDTA （pH 8.0）；SDS 提 取 緩 沖 液 ：100 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）；20 mmol/L EDTA；10%SDS；1.4 mol/L NaCl；Tris 飽和酚+氯仿 （25∶24，V/V）；50 mg/mL溶菌酶溶液；1mg/mL RNase A；1%瓊脂糖 凝 膠 ；70 ng/μL DNA 模 板 ；2.5 mmol/L dNTP Mixture；10×ExTaq Buffer （Mg2+pluse ）；20 μmol/L 27F；20 μmol/L 1495F；ExTaq DNA 聚合酶。

2 方法

2.1 樣品的采集和處理 選取新鮮兔子的糞便約150 g，裝入滅菌后的塑料袋內。4℃冰箱中保存。

2.2 分離和初篩 稱取兔子糞便10 g，放入含90 mL無菌水和十幾粒玻璃珠的250 mL三角瓶中，搖床200 r/min旋轉搖動10 min，使成均勻的10-1g/mL菌懸液，置80℃水浴20 min，然后進行10 倍梯度稀釋。選取 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等稀釋梯度，涂布在初篩培養基平板上，置于37℃培養箱中培養，2～5 d后觀察并挑取能夠在初篩培養基平板形成透明圈的菌落，在NA培養基平板上劃線純化后，連續重復3次點接在初篩培養基平板上，37℃培養48 h，挑取透明圈直徑和菌落直徑比值較大的菌落，37℃培養1～2 d后4℃保存備用。

2.3 β-葡聚糖酶活力測定 配制液體發酵產酶培養基，調節pH至7.0，分別倒入250 mL三角瓶，裝液量為50 mL，分別接入初篩得到的具有較大水解圈的菌株，37℃條件下220 r/min旋轉搖床培養48 h，發酵液經4℃、10000 r/min離心5 min，取清液，備用。

2.3.1 測定原理 β-葡聚糖酶能將β-葡聚糖降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和有還原基團的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發生顯色反應。反應液顏色的強度與酶解產生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應液中β-葡聚糖酶的活力成正比。因此，通過分光比色測定反應液顏色的強度，可以計算反應液中β-葡聚糖酶的活力。

在37℃、pH為5.5的條件下，每分鐘從濃度為4 mg/mL的β-葡聚糖溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位（U）。

2.3.2 測定方法 β-葡聚糖酶活力采用分光光度法測定（NY/T 911-2004）。以菌株產β-葡聚糖酶活力的高低作為評價指標，篩選酶活力較高的菌株作為微生物發酵消除谷物中抗營養因子的供試菌株。

2.4 菌種鑒定

2.4.1 形態鑒定 菌落形態觀察：挑取少量NA斜面上30℃培養24 h的T-4-3菌株至裝有10 mL無菌水的試管中，充分混勻后取1 mL至裝有9 mL無菌水的試管中，依次稀釋得到不同濃度的菌懸液。分別取10-4、10-5稀釋梯度的稀釋液0.1 mL涂布NA培養基平板，然后倒置于30℃培養箱中培養24 h，觀察菌落形態。

菌體形態觀察：挑取NA斜面上30℃培養24 h的T-4-3菌株，參照《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）的方法進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態。

2.4.2 生理生化鑒定 參照 《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）的方法對T-4-3菌株分別進行接觸酶，V.P測定，淀粉水解，硝酸鹽還原，亞硝酸鹽還原，檸檬酸鹽利用，明膠液化，甲基紅試驗，纖維素分解，酪素水解，吲哚試驗，丙二酸鹽利用，耐鹽性試驗，糖、醇類發酵，生長溫度等生理生化試驗。

2.4.3 DNA提取和16S rDNA基因擴增 參考Kim 等（1995）和 Rainey 等（1996）的方法提取細菌總DNA。取對數生長期的待鑒定菌株的發酵液1.5 mL，8000 r/min 離心去菌體。懸于 400 μL TE 緩沖液，加入50 mg/mL的溶菌酶溶液20 μL，37℃過夜溫育。加入400 μL SDS提取緩沖液，65℃溫育45 min，冷卻至室溫，加入400 μL的Tris飽和酚+氯仿（25∶24，V/V），混勻后 12000 r/min 離心 10 min，上相用等體積的氯仿抽提，混勻后12000 r/min離心，10 min后上相用1倍體積冰冷的異丙醇沉淀DNA，-20℃靜置30 min，室溫干燥后溶于200 μL TE 緩沖液，加入 20 μL RNAase（1 mg/mL），37℃，30 min。室溫干燥后溶于30 μL TE緩沖液，1%瓊脂糖電泳檢測DNA質量，估計提取的DNA濃度。

引物為通用引物 （Lane，1991）， 正向引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'。 反向引物為 1495R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。分別位于16S rDNA的8～27和1495～1514位的堿基片段 （以Escherichia coli的16S rDNA堿基位置為準）。

PCR 反應體系：DNA（70 ng/μL）模板 2 μL；dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.5 μL；27F（20 μmol/L）1.5 μL；1495F （20 μmol/L）1.5 μL；10 ×ExTaq Buffer （Mg2+pluse）5 μL；ExTaq DNA 聚合酶 0.2 μL；補足 ddH2O 至 50 μL。

PCR條件為：94℃預變性3 min；然后94℃變性 1 min，55 ℃退火 1 min，72℃延伸 3 min，共30個循環；最后72℃延伸5 min。PCR產物經試劑盒純化后測序。

2.4.4 16S rDNA序列分析及系統發育樹繪制將所測得的16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank數據庫進行相似性分析，并與GenBank中的相近序列在Clustal X（1.8）程序包中進行多重序列匹配排列（Multiple alignments）分析，最后形成一個多重序列匹配排列陣，其中形成的缺口用“-”填補，用Neighbor-Joining法構建系統發育樹（Saitou 和 Nei，1987）。

3 結果與分析

3.1 初篩 本試驗以是否能水解β-葡聚糖從而在剛果紅平板上產生水解圈來判定是否為產β-葡聚糖酶菌株，共篩選出菌株28株，水解圈直徑與菌落直徑比在2.0以上的菌株有16株，5.0以上的菌株有4株，分別是T-4-2、T-4-3、D-5-1、L-3-9，其中D-5-1的直徑比最高，達到13.09，如表1所示。

表1 初篩所得菌株的直徑

3.2 β-葡聚糖酶活力測定 將初篩所得菌株在液體發酵產酶培養基中進行發酵培養。采用DNS法定量測定發酵后上清液的酶活力。其中酶活力在4.0 U/mL以上的有14株，結果如表2所示，其中 T-4-3菌株酶活力最高，達到21.9 U/mL。

表2 菌株產酶活力 U/mL

3.3 菌株T-4-3的鑒定

3.3.1 菌落形態 菌株在NA平板上生長，單菌落呈近圓形，邊緣整齊，中央隆起，不透明，近白色，表面光滑。

3.3.2 菌體形態 在NA試管斜面上培養24 h的菌體進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察，革蘭氏陽性，芽孢呈橢圓形中生，菌體具抗酸性，可產生異染粒，菌體生長物向四周呈云霧狀擴散。

3.3.3 生理生化試驗結果 按 《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）中的方法進行生理生化試驗，結果見表3。

表3 T-4-3菌株的生理生化特征

綜合以上T-4-3菌株的形態特征和生理生化特性，對照《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行檢索，初步將其鑒定為芽孢桿菌屬。

3.3.4 T-4-3菌株的系統發育分析 為進一步確定T-4-3菌株的分類學地位，需測定其16S rDNA基因序列。經測定，T-4-3菌株序列長度為1448 bp。將T-4-3菌株的16S rDNA基因序列在GenBank中進行Blast相似性分析，并將Genbank中與T-4-3菌株相似性較高的7個菌株構建系統進化樹。結果如圖1和表4所示，供試菌株的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬的標準菌株同源相似度大部分在99%以上；T-4-3菌株與CP000560 Bacillus amyloliquefaciens和AY603658 Bacillus velezensis序列相似性高達100%。綜合以上T-4-3菌株的形態特征、生理生化特性及16S rDNA基因序列的分析結果，鑒定T-4-3菌株為Bacillus amyloliquefaciens。

圖1 T-4-3菌株的16S rDNA序列系統發育樹

表4 T-4-3菌株與幾種標準菌株的相似性比較

4 結論

本試驗采用剛果紅平板法初篩和搖瓶復篩相結合的方法從動物糞便中分離和篩選到一株β-葡聚糖酶活力較高的菌株T-4-3，酶活力達到21.9U/mL。對該菌株進行形態觀察、生理生化特征分析，初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.），將其16S rDNA序列與GeneBank中已知標準菌株的16S rDNA序列進行比對，并用Neighbor-joining方法構建菌株T-4-3進化樹，結果表明，T-4-3與標準菌株CP000560 Bacillus amyloliquefaciens聚于同一分支，同源性高達100%。

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