基因擴(kuò)增聯(lián)合測(cè)序法對(duì)痰標(biāo)本分離的60株真菌病原學(xué)鑒定＊

陜西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（西安710068）

胡淑玲 安 娜△ 劉先寧△▲ 張利俠 王亞妮△ 朱娟莉△ 朱秀萍△

隨著廣譜抗生素、激素和免疫抑制劑等藥物的廣泛應(yīng)用，以及腫瘤患者、老年病人抵抗力的下降，使得深部真菌感染的機(jī)會(huì)愈來(lái)愈多。肺部感染居深部真菌感染的首位，如不及時(shí)診治，病死率極高。快速、準(zhǔn)確的診斷是治療和搶救的關(guān)鍵。PCR技術(shù)的發(fā)展，使痰標(biāo)本中真菌種屬的快速鑒定得以實(shí)現(xiàn)。采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer region，ITS）序列分析已用于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析［1］。本文采用已建立的PCR擴(kuò)增ITS2區(qū)聯(lián)合基因序列比對(duì)方法［2］，對(duì)痰標(biāo)本分離的60株真菌和2種標(biāo)準(zhǔn)真菌株進(jìn)行種屬鑒定，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

1 材料來(lái)源 收集2012年2月至9月，在陜西省人民醫(yī)院就診，檢驗(yàn)科細(xì)菌室進(jìn)行痰標(biāo)本分離培養(yǎng)、涂片后顯微鏡檢確診為真菌的菌落標(biāo)本60份。本組病例中，男51例，女9例，平均年齡（72．5±0．5歲）。病人來(lái)自呼吸科、老年病腫瘤科、老年病呼吸科、神經(jīng)內(nèi)科、干部病房科、血液病科等。標(biāo)準(zhǔn)真菌菌株：煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus），白色念珠菌（Candida albicans）均購(gòu)于陜西省微生物研究所菌種保藏中心。

2 試劑與儀器 真菌基因組DNA提取試劑盒DNeasy Plant Mini Kit購(gòu)于德國(guó) Qiagen公司；2×Taq plus PCR Master Mix購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；DNA Marker購(gòu)于大連Ta Ka Ra生物工程有限公司；引物合成和PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成；Mastercycler gradient PCR儀購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；電泳儀和紫外分析儀購(gòu)于北京六一儀器廠。

3 檢測(cè)方法

3．1 真菌 DNA 提取：參見文獻(xiàn)［3，4］，分別取標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落及痰標(biāo)本分離的真菌菌落約10mg置于5ml離心管中，加液氮研磨成粉狀，然后按照DNeasy Plant Mini Kit試劑盒說(shuō)明書的提取步驟提取真菌基因組DNA，得到10～50ng／μl的DNA溶液。

3．2 PCR擴(kuò)增ITS2區(qū)：PCR擴(kuò)增引物采用通用引物序列，引物ITS1的序列（5′～3′）為 TCCGTAGGTGAACCTGCGG，其長(zhǎng)度為19bp，引物ITS4的序列（5′～3′）為 TCCTCCGCTTATTGATATGC，其長(zhǎng)度為20bp。PCR反應(yīng)體系：總體積30μl，其中模板為提取的真菌DNA 2μl（陰性對(duì)照用等體積的無(wú)菌去離子水），引物ITS1，ITS4 各 1μl，2×Taq plus PCR Master Mix 15μl，無(wú)菌去離子水11μl；反應(yīng)程序95℃預(yù)變性5min后，95℃30s，55℃ 1min，72℃1 min共計(jì)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸6min，-20℃保存?zhèn)溆谩U(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

3．3 序列比對(duì)與種屬分析：測(cè)序結(jié)果采用美國(guó)國(guó)立生物 信 息 中 心 （National Center for Biotechnology Information，NCBI）的BLAST工具，基因庫(kù)中真菌核酸序列比對(duì)，確定其種屬并進(jìn)一步進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1 PCR擴(kuò)增ITS2區(qū)的檢驗(yàn)結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳顯示，2種標(biāo)準(zhǔn)菌株以及痰標(biāo)本分離的真菌菌株在500bp左右有擴(kuò)增條帶。

2 PCR產(chǎn)物測(cè)序及真菌種屬鑒定結(jié)果 PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具，并與基因庫(kù)中的真菌核酸序列比對(duì)，鑒定真菌種屬。2種標(biāo)準(zhǔn)菌的PCR產(chǎn)物序列經(jīng)比對(duì)與基因庫(kù)中一致。60株痰標(biāo)本分離的真菌株與基因庫(kù)中的真菌核酸序列比對(duì)后，曲霉菌屬24株，青霉菌屬4株，念珠菌屬29株，其它絲狀菌還有暗孢節(jié)菱孢菌2株，淡紫擬青霉菌1株和串珠狀赤霉菌1株。結(jié)果見附表。

附表 60株痰標(biāo)本分離的真菌株種屬及構(gòu)成比

討 論

近年來(lái)，深部真菌感染的發(fā)病率不斷上升。2004年的調(diào)查結(jié)果表明，真菌感染率為20世紀(jì)90年代的2．4倍，2003年北京協(xié)和醫(yī)院統(tǒng)計(jì)的侵襲性真菌感染發(fā)生率是20世紀(jì)90年代的3．6倍 ，且以念珠菌屬和曲霉菌屬為主［5，6］。

本研究采用基因測(cè)序法對(duì)痰標(biāo)本分離的60例真菌進(jìn)行種屬分析，其中念珠菌菌屬占48%，曲霉菌屬占40%，青霉菌占5%，其它絲狀菌占7%，與上述研究結(jié)果一致。另外還檢測(cè)到了暗孢節(jié)菱孢菌（3%）、串珠狀赤霉菌（2%）等罕見報(bào)道的真菌。

致病性真菌的鑒定對(duì)深部真菌感染的診治具有重要意義，目前臨床上仍以表型鑒定為主，但該方法專業(yè)技術(shù)要求較高，耗時(shí)長(zhǎng)，且對(duì)某些致病菌種往往不能準(zhǔn)確鑒定［7］。而以基因序列為鑒定基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法對(duì)具有種間差異性和種內(nèi)保守性的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后進(jìn)行序列測(cè)定，并在數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)得到鑒定結(jié)果，這種測(cè)序的方法由于客觀、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，目前在病原真菌的鑒定中常被認(rèn)為是分子鑒定的 “金標(biāo)準(zhǔn)”［8］。

基因測(cè)序法能快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地鑒別痰培養(yǎng)的真菌種屬，為本地區(qū)呼吸道真菌性疾病病原菌流行病學(xué)調(diào)查及個(gè)性化治療奠定基礎(chǔ)。

［1］ Balajee SA，Borman AM，Brandt ME，etal．Sequencebased identification of Aspergillus，fusarium，and mucorales species in the clinical mycology laboratory：Where are we and where should we go from here？［J］．J Clin Microbiol，2009，47（4）：877-84．

［2］ 劉先寧，胡淑玲，安 娜，等．半巢氏PCR擴(kuò)增聯(lián)合基因測(cè)序鑒定絲狀真菌的實(shí)驗(yàn)研究［J］．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，28（50）：48-52．

［3］ 安 娜，王亞妮，劉先寧，等．真菌性角膜炎致病菌種屬的PCR鑒定［J］．眼科新進(jìn)展，2010，30（11）：1017-1020．

［4］ 楊瀟遠(yuǎn)，李振勇，屈超義．角膜炎常見致病真菌DNA快速提取方法的探索［J］．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，（9）：86．

［5］ 馬 軍．侵襲性真菌感染的流行病學(xué)［J］．中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85（21）：1443-1444．

［6］ 劉正印，盛瑞媛，李旭麗，等．院內(nèi)真菌感染149例分析［J］．中華醫(yī)學(xué)雜志，2003，83（5）：399-402．

［7］ Cuenca Estrella M，Bernal-Martinez L，Buitrago MJ，etal．Update on the epidemiology and diagnosis of invasive fungalinfection［J］．Int J Antimicrob Agents，2008，32Suppl 2：S143-147．

［8］ Balajee SA，Borman AM，Brandt ME，etal．Sequence based identification of Aspergillus，fusarium，and mucorales species in the clinical mycology laboratory：Where are we and where should we go from here7［J］．J Clin Microbiol，2009，47：877-884．