咳喘寧對哮喘大鼠TLR4表達的影響

摘要：目的 觀察咳喘寧對哮喘大鼠TLR4表達的影響，闡明其防治哮喘的作用機理。方法 用卵清蛋白復制大鼠哮喘模型，以布地奈德為陽性對照藥，觀察咳喘寧干預后肺泡灌洗液中、肺組織中TLR-4的改變情況。結果 TLR4在哮喘大鼠支氣管粘膜上皮細胞、肺泡中有顯著表達。咳喘寧能有效降低哮喘大鼠中TLR4的表達，從而減輕了氣道的高反應性。布地奈德減少支氣管粘膜、肺泡胞漿中TLR4的表達優于咳喘寧，差別無統計學意義。結論 咳喘寧能降低TLR4表達水平，提示咳喘寧治療哮喘可能與下調TLR4表達水平有關。

關鍵詞：哮喘；咳喘寧；TLR-4；麻黃；杏仁

支氣管哮喘（bronchial asthnla。簡稱哮喘）是最常見的慢性肺部疾病。我國兒童哮喘總發病率為0.9%～1.1%，其中半數在3歲以前發病[1]，近年來發病率有明顯上升趨勢。該病是以特應質為基礎。在各種誘發因索作用下產生的慢性氣道變應性炎癥。迄今為止，其發病機制仍未完全明確。大量研究顯示，Toll樣受體（Tolllike receptors，TLRs）是天然免疫和獲得性免疫之間的橋梁，在哮喘的發生發展中可能起著較重要的作用[2]。咳喘寧對小兒哮喘有較好的療效，為了探討其作用機理，觀察其對哮喘大鼠TLR4表達的影響。現將實驗方法及結果報告如下：

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1動物 幼年SD大鼠（清潔級，120～180g，雄性，28～42d）分成四組：正常組、模型組、咳喘寧治療組、布地奈德組。

1.1.2藥物 咳喘寧由炙麻黃、杏仁、桃仁、大青葉、黃芪、生石膏、細茶和甘草等中藥組成。湖南中醫藥大學第一臨床醫學院制劑室提供，批號：200501，每100mL含生藥24.6g。

1.1.3試劑及儀器 雞卵清蛋白，美國Sigma公司；氫氧化鋁（分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司；TLR4抗體，武漢博士德；自制霧化箱；醫用超生霧化器，上海四菱醫用恒溫設備有限公司；自動純水雙蒸餾器，上海玻璃儀器一廠；普通離心機（低速），湖南儀器儀表總廠離心機廠；4℃冰箱；微波爐；37℃溫箱一臺；石蠟包埋機、切片機；光學顯微鏡。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型制 50只大鼠飼養于湖南中醫藥大學潔凈動物實驗室，每5只1籠，自由飲食，控制室溫21 ℃左右，濕度55%左右。所有動物適應性飼養1周后開始實驗。隨機抽出16只作為A組即正常組，除A組外，其余34只大鼠分別于第1d和第8d分在胸部皮下三點及腹腔注射共1 mL含1 mg卵清蛋白（OVA）和100 mg氫氧化鋁凝膠的無菌抗原液致敏，正常組于第1d和第8d分胸部皮下三點及腹腔注射生理鹽水1ml；第9d～第21d為激發階段，通過超聲霧化器以5%卵清蛋白溶液霧化1次/d，30 min/次，連續2w。造模成功后34只大鼠隨機分為四組：模型組（10只），布地奈德組（12只），咳喘寧組（12只）。

1.2.2治療方案 造模后（激發階段）進行治療。霧化2次/d，20min/次。按照《藥理學實驗方法學》[3]人與動物等效劑量換算方法，各組藥物用量如下：咳喘寧組以咳喘寧口服液霧化，每只量為0.66ml/次，溶于20 mL蒸餾水中霧化；布地奈德組以布地奈德每只0.05 ml/次，溶于20ml蒸餾水中霧化；正常組及模型組以等量蒸餾水霧化吸人。各組霧化治療時間均為7 d。

1.2.3免疫組化染色 動物處死后切取肺組織，冰凍后行超薄切片（5u m）后用冷丙酮固定。后行TLR-4免疫組織化學染色。以細胞質染成棕黃色的細胞為TLR-4陽性細胞。

1.2.4圖像分析、統計學處理 各種免疫組化陽性反應強度用圖像分析系統進行定量分析。陽性反應強度應用圖像分析系統灰度值（灰度值與陽性強度呈現反比） 表示。應用SPSS軟件包AVONA方差分析差異顯著性分析，所有數據用\"均數±標準差\"表示。

2結果

2.1肺組織病理形態改變 正常組氣道粘膜完整無脫落，基膜無增厚，支氣管管壁及周圍炎性細胞浸潤少見，模型組呈顯著炎癥變化，氣道粘膜脫落，基膜增厚明顯，肺泡內大量炎癥細胞，支氣管內有粘液栓形成，周圍大量炎癥細胞浸潤。布地奈德組氣道粘膜增厚不明顯，粘膜下水腫少見，在肺泡壁支氣管見少量炎性細胞浸潤，咳喘寧組輕度炎癥變化，較布地奈德組無明顯差異。哮喘模型建立成功，咳喘寧治療哮喘大鼠有效，且效果與布地奈德無明顯差異。

2.2肺組織TLR4表達變化 免疫組化染色結果顯示，TLR4陽性表達呈棕黃色或棕褐色，主要位于支氣管粘膜及肺泡的細胞質中，細胞核及細胞膜中亦可見。TLR4在正常組偶見陽性表達；哮喘模型組表達增加，可見大量陽性反應細胞，主要分布在氣管黏膜及肺泡中；咳喘寧組、布地奈德組陽性細胞表達較哮喘模型組明顯減少，但仍較正常組顯著，呈陽性表達。其中布地奈德組稍優于咳喘寧組。模型組TLR4陽性表達圖像分析的灰度值（113.08±14.12）低于其他三組，組間比較均有顯著差異（P<0.05），提示正常組支氣管粘膜上皮細胞胞漿及肺泡中陽性表達明顯高于其他三組。布地奈德組灰度值（149.24±3.22）與咳喘寧組灰度值（133.32±5.38）較模型組有顯著差異（P<0.05）。咳喘寧組的陽性表達與布地奈德組相較強，但無有統計學意義，見表1。

3討論

研究表明，Toll樣受體（toll likereceptor，TI R）介導天然免疫并連接獲得性免疫，在氣道炎癥的調節中起重要作用，特別是TI R4介導的免疫反應參與了復雜的哮喘氣道高反應形成過程。在哮喘氣道炎癥中，Th2細胞的優勢應答是哮喘慢性氣道炎癥形成的基礎。在過敏性氣道炎癥中，TLR4與適應性免疫調控聯系緊密，其主要通過TLR4與適應性免疫調控聯系緊密，其主要通過調節Thl/Th2型免疫應答參與了氣道高反應形成[4]。既往研究認為，TLR4配體LPS水平決定氣道炎癥反應的類型：低劑量LPS能引起伴有肺嗜酸粒細胞、高血清IgE、IL-4、IL-5和IL-13水平的變應原特異性Th2應答；高劑量LPS則引起伴有中性粒細胞和IgG抗體產生的Thl應答。哮喘的嚴重程度與TLR4水平高低有關系，表明哮喘發作與TLR4有密切關系。

中醫學認為.哮喘內有痰飲留伏，外因邪氣引動而誘發。感受六淫外邪以風寒風熱為多[5]。咳喘寧口服液以傳統古方五虎湯為基本方研制而成。方中麻黃乃\"喘家圣藥\"，味苦辛、性溫，能宣肺氣，平咳喘，其主要含麻黃堿，具有抗炎、平喘和抗過敏效應；苦杏仁味苦、性微溫，能降肺氣平喘止咳。二藥有宣有降，可祛除外邪，暢通氣道，從而降低氣道反應性，共為本方君藥。石膏味辛甘、性大寒，功在清泄肺熱；大青葉清熱抗炎，具有抗病毒作用；黃芪扶正祛邪，能增強機體免疫功能，增強病毒誘生干擾素的能力，抑制病毒，并具有類似激素樣作用。三藥合用，可清除哮喘的激發因素，共為本方臣藥。桃仁活血化瘀以改善微循環，改善炎癥病灶，尚可止咳平喘；細茶葉昧苦甘、性寒，功在清神化痰；甘草鎮咳平喘，具有抗炎、抗變態反應作用，共為本方佐使。諸藥合用，共奏發表清熱、化痰平喘、清除哮喘激發因素、降低氣道反應性等功效[6]。

既往研究表明：咳喘寧治療病毒誘發的哮喘具有較好的療效，能顯著提高哮喘患兒血中Ⅱ-12、降低IL-4，其作用明顯優于對照組（P<0.01）[7]。咳喘寧能降低肺組織中EOS浸潤，從而降低了氣道反應性和平滑肌收縮程度，緩解了支氣管痙攣[8]。在此基礎上，本實驗進一步發現咳喘寧能降低哮喘大鼠中TLR4的表達，從而減輕了氣道的高反應性。

參考文獻：

[1]中華醫學會兒科分會呼吸學組，中華兒科雜志編輯委員會.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[J].中華兒科雜志，2008，46：745.

[2]Chen I， Wang T， Zhang JY， et al. Toll-like receptor 4 relates to lipopolysaccharide-induced mucus hypersecretion in rat airway.Arch M ed Res，2009，40：10-17.

[3]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學（第二版）[M].北京：人民衛生出版社，1991：178-179.

[4]Le Buanec H. Paturance S. Couillin I， et al. Control of allergic reactions in mice by an active anti murine II-4 immunization.Vaccine，2007，25：7206-7216.

[5]羅銀河.中醫藥治療小兒L支氣管哮喘的研究進展[J].湖南中醫學院學報，2005，25（6）：62.

[6]王盂清，羅銀河，陳錫軍.咳喘寧治療病毒誘發的小兒哮喘的臨床研究[J].額中醫，2007，39（4）：1-17.

[7]王孟清，羅銀河，陳錫軍.咳喘寧治療病毒誘發哮喘及對患兒Th亞群的調節作用[J].中醫兒科雜志，2007，3（2）：28-30.

[8]董曉斐，羅銀河，王孟清.咳喘寧對哮喘豚鼠EOS的調節作用[J].湖南中醫藥大學學報.2008，28（5）：36.編輯/申磊