尿多酸肽作用于肺腫瘤小鼠的研究

摘要：目的 研究尿多酸肽（CDA-2）作用于轉(zhuǎn)移性肺腫瘤小鼠的機(jī)制。方法 通過(guò)注射鼠Lewis 肺癌細(xì)胞到C57BL/6小鼠體內(nèi)建立小鼠轉(zhuǎn)移性肺癌模型。采用HE染色對(duì)小鼠肺部腫瘤數(shù)、腫瘤大小進(jìn)行評(píng)價(jià)。利用Kaplan-Meier（K-M）生存率曲線分析小鼠生存情況。免疫組化方法檢測(cè)小鼠腫瘤增殖抗原Ki-67的表達(dá)；TUNEL凋亡免疫組化染色觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡。結(jié)果 經(jīng)CDA-2治療后，小鼠的肺腫瘤數(shù)和最大腫瘤尺寸均顯著低于PBS組腫瘤小鼠，并且CDA-2呈劑量依賴性抑制腫瘤的生長(zhǎng)（均P<0.05）。K-M結(jié)果顯示，使用PBS組腫瘤小鼠的生存時(shí)間顯著低于CDA-2治療組，且隨著CDA-2劑量增加腫瘤小鼠生存時(shí)間不斷延長(zhǎng)。免疫組化染色結(jié)果顯示，肺腫瘤小鼠經(jīng)CDA-2治療后，Ki-67陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)顯著低于PBS治療的腫瘤小鼠（P<0.05）；而腫瘤凋亡細(xì)胞數(shù)卻明顯高于PBS組（P<0.001）。結(jié)論 CDA-2可抑制小鼠肺癌的生長(zhǎng)；延長(zhǎng)肺癌小鼠的生存期；抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：尿多酸肽；肺癌；腫瘤生長(zhǎng)；生存期；增殖；凋亡

根據(jù)2010年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌已成為全球死亡率最高的腫瘤[1]，其主要原因是患者在發(fā)現(xiàn)肺癌時(shí)多處于中晚期且現(xiàn)有的治療方案，如手術(shù)、放療和化療等，均存在一定缺陷，不能起到有效的治療作用。尿多酸肽（cell differentiation agent 2，CDA-2）作為我國(guó)研發(fā)的一種抗腫瘤新藥，是從健康人尿中分離提取的含有天然活性成分的非細(xì)胞毒性藥物，該藥具有促進(jìn)細(xì)胞分化及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等功能[2]。前期臨床研究顯示，CDA-2對(duì)白血病和肝癌等多種實(shí)體和非實(shí)體腫瘤有較好療效及防預(yù)[3，4]。本研究通過(guò)建立小鼠轉(zhuǎn)移性肺癌模型，觀察CDA-2對(duì)小鼠肺部腫瘤生長(zhǎng)的影響、腫瘤小鼠生存時(shí)間的影響及腫瘤細(xì)胞增殖或凋亡的影響，來(lái)初步了解CDA-2在肺癌治療中的作用。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6雌性小鼠購(gòu)自國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心上海分中心。

1.2主要試劑 胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone Laboratories 公司；CDA-2由合肥永安制藥有限公司惠贈(zèng)；鼠抗Ki-67 購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；EnVision +System-HRP （AEC）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Dako公司；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 鼠Lewis 肺癌 （Lewis lung carcinoma，LLC）細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)菌種保藏中心，在DMEM完全培養(yǎng)液（添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素） 中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.2 動(dòng)物模型的建立及CDA-2治療方案 通過(guò)尾靜脈注射法，將2×105個(gè)LLC腫瘤細(xì)胞注射到C57BL/6小鼠體內(nèi)。14d后， PBS（對(duì)照組）及不同濃度CDA-2（500，1000，2000 mg/kg）分別通過(guò)腹腔注射入小鼠體內(nèi)，1次/d連續(xù)10d。

1.3.3小鼠肺腫瘤評(píng)價(jià)方法 根據(jù)文獻(xiàn)[5]對(duì)小鼠肺腫瘤的腫瘤數(shù)和最大腫瘤尺寸進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體方法：在第25d，PBS組和CDA-2組小鼠被處死，先用4%多聚甲醛經(jīng)小鼠氣管對(duì)腫瘤負(fù)荷的肺進(jìn)行灌注，然后將整個(gè)肺取出，存放到4%多聚甲醛中固定。固定24h后，全肺被石蠟包埋。將肺腫瘤石蠟塊切成連續(xù)的350 mm的切片，用HE染色后，對(duì)肺腫瘤進(jìn)行計(jì)數(shù)和測(cè)量腫瘤的尺寸。

1.3.4免疫組化檢測(cè) 腫瘤負(fù)荷肺組織用4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋、切片。切片經(jīng)60℃孵育過(guò)夜后脫蠟，再將其放于0.01M檸檬酸緩沖液（pH6.0）中，微波爐100℃加熱20min進(jìn)行抗原修復(fù)。切片用3% H2O2抑制非特異性氧化酶后，在2% 封閉液中孵育60min，然后加Ki-67抗體4℃孵育過(guò)夜，根據(jù)EnVision +System-HRP （AEC）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行第二抗體的孵育和染色，復(fù)染使用蘇木精。Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)方法：每張切片選擇6個(gè)高倍視野，共觀察1000個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞比例，以百分率代表Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比率。

1.3.5 TUNEL檢測(cè) 蠟塊按常規(guī)切片， TUNEL檢測(cè)操作按Promega公司細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)范進(jìn)行。設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞棕黃色顆粒位于細(xì)胞核。每張切片選擇6個(gè)高倍視野，共觀察1000個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞比例，以百分率代表腫瘤細(xì)胞凋亡率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。兩組或多組間比較采用t檢驗(yàn)和Kaplan-Meier生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 CDA-2對(duì)小鼠轉(zhuǎn)移性肺癌生長(zhǎng)的影響 用PBS及500～2000mg/kg CDA-2分別注射到轉(zhuǎn)移性肺腫瘤小鼠體內(nèi)，連續(xù)10d后，觀察小鼠肺部腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)合小鼠肺外觀及HE染色結(jié)果顯示，注射PBS的腫瘤小鼠其腫瘤數(shù)為（45.2±10.6）個(gè)，最大的腫瘤尺寸達(dá)到了（5.4±0.4）mm，而腫瘤小鼠注射CDA-2后腫瘤數(shù)及最大腫瘤尺寸均有顯著降低（P<0.05）， 且呈劑量依賴性腫瘤抑制。當(dāng)CDA-2注射劑量從500mg/kg增加至2000mg/kg時(shí)， 其腫瘤數(shù)從（32.4±5.2）個(gè)降低到（9.6±3.1）個(gè)，而最大腫瘤尺寸從（4.2±0.6）mm下降到（1.7±0.6）mm（表1，圖1）。

圖1 腫瘤小鼠注射PBS和不同濃度CDA-2后肺腫瘤形態(tài)（上）及HE染色結(jié)果（下）

2.2 CDA-2對(duì)腫瘤小鼠生存時(shí)間的影響 部分注射了PBS或500～2000mg/kg CDA-2的肺腫瘤小鼠被用于觀察生存時(shí)間的長(zhǎng)短，結(jié)果顯示，經(jīng)PBS處理的肺腫瘤小鼠平均壽命為28.1d，而CDA-2治療的腫瘤負(fù)荷小鼠隨著藥物劑量的增加其壽命也不斷延長(zhǎng)， 500mg/kg CDA-2治療后小鼠平均壽命為35.5d，1000mg/kg CDA-2治療后為40.1d，而2000mg/kg CDA-2治療后小鼠平均壽命延長(zhǎng)至45.9d（圖2）。

圖2 肺腫瘤小鼠注射不同濃度CDA-2后的生存時(shí)間比較

2.3 CDA-2與肺腫瘤細(xì)胞的關(guān)系 為了進(jìn)一步了解CDA-2對(duì)肺腫瘤細(xì)胞的作用，Ki-67免疫組化方法和TUNEL方法分別用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡情況。結(jié)果顯示，注射PBS的腫瘤小鼠Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞為（38.6±13.3）%，而腫瘤小鼠經(jīng)2000mg/kgCDA-2處理后，其Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞為（10.8±4.3）%，兩組比較Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有顯著降低（P<0.01）。反之，2000mg/kgCDA-2處理后小鼠的腫瘤凋亡細(xì)胞（57.8±8.7）%相較于PBS處理組（5.8±3.2）%有明顯升高（P<0.001）（圖3，表2）。

3討論

近年來(lái)，隨著肺癌發(fā)病率及死亡率的不斷升高，越來(lái)越多的研究小組致力于肺癌治療的研究。但現(xiàn)有治療方法均存在一定缺陷，因此，抗肺癌新方法的研究迫在眉睫。CDA-2包含多種活性成份：苯乙酰谷氨酰胺，馬尿酸，肽（MW400-2800），4-羥基苯乙酸，5-羥基吲哚乙酸[2]。目前已被發(fā)現(xiàn)具有多種生物功效，如抗腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞分化及調(diào)控基因表達(dá)等[6]，同時(shí)可以保護(hù)正常細(xì)胞的氧化損傷及DNA損傷[7]。在本研究中，我們首次通過(guò)建立轉(zhuǎn)移性肺腫瘤小鼠模型來(lái)研究CDA-2對(duì)肺癌的作用，結(jié)果顯示：CDA-2可抑制小鼠轉(zhuǎn)移性肺癌的生長(zhǎng)且隨著劑量的增加延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間；而在細(xì)胞層面，CDA-2可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

前期臨床研究顯示，CDA-2對(duì)于肝癌、乳腺癌、大腸癌及白血病等多種實(shí)體和非實(shí)體腫瘤均具有較好的療效，可控制腫瘤的生長(zhǎng)且改善患者的生活質(zhì)量[8]。在肺癌研究中也發(fā)現(xiàn)尿多酸肽聯(lián)合NP方案（長(zhǎng)春瑞濱NVB、順鉑DDP）治療晚期非小細(xì)胞肺癌患者，具有一定的療效可減輕化療毒副作用且可顯著延長(zhǎng)患者的生存期[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們得到了與以往研究一致的結(jié)果，結(jié)果顯示CDA-2可顯著抑制小鼠的肺部腫瘤生長(zhǎng)且腫瘤個(gè)數(shù)及腫瘤大小隨著CDA-2劑量的增加而減小。并利用K-M曲線分析了CDA-2劑量與腫瘤小鼠生存時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果顯示CDA-2治療腫瘤小鼠后其生存期與對(duì)照組比較有顯著的延長(zhǎng)且與CDA-2劑量呈正相關(guān)。

無(wú)限制增殖是惡性腫瘤細(xì)胞最顯著的生物特征之一；而凋亡是維護(hù)機(jī)體穩(wěn)定而發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡，凋亡途徑的紊亂也可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。大量研究表明CDA-2可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如葉東寶等的報(bào)告顯示CDA-2可明顯抑制人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞株的凋亡[10]；在王紅兵等發(fā)表的肺癌體外研究報(bào)告中顯示，CDA-2可有效的抑制肺腺癌細(xì)胞株A549的增殖，并呈CDA-2劑量依賴性抑制[11]；王旋等的體外研究報(bào)告發(fā)現(xiàn)CDA-2可顯著誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞株A549的細(xì)胞凋亡[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們將CDA-2作用于肺腫瘤小鼠，通過(guò)免疫組化染色及TUNEL方法檢測(cè)小鼠肺腫瘤細(xì)胞的增殖率及凋亡率，結(jié)果顯示腫瘤小鼠經(jīng)CDA-2治療后腫瘤細(xì)胞的增殖率不斷降低，反之凋亡細(xì)胞數(shù)不斷升高，得與其他研究結(jié)論相似。

綜上所述，CDA-2作為一種新型的抗腫瘤藥物，可有效抑制小鼠轉(zhuǎn)移性肺癌的生長(zhǎng)并可顯著延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間，且主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)產(chǎn)生作用。

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編輯/申磊