大鼠酒精性心肌病心肌超微結(jié)構(gòu)及血清TNF—α和MDA的變化及意義

摘要：目的 研究大鼠酒精性心肌病（ACM）心肌超微結(jié)構(gòu)及血清TNF-α和MDA的變化及意義。方法 采用灌胃法制備大鼠酒精性心肌病模型，模型組用40%酒精8g/（kg.d）分二次灌胃共12w，對照組灌等量的生理鹽水，實驗第8、12w末分批處死動物。用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)，測量血清TNF-α和MDA的變化。結(jié)果 與對照組相比模型組模型組可見大鼠心肌病變及炎性細(xì)胞浸潤及血清TNF-α和MDA的變化。結(jié)論 長期攝入酒精可引起大鼠酒精性心肌病，TNF-α和MDA在酒精性心肌病過程中的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：酒精性心肌病；腫瘤壞死因子；丙二醛；電子顯微鏡；大鼠

酒精性心肌病（alcoholic cardiomyopathy （ACM））是指由于酒精長期攝入過量而導(dǎo)致的心肌損害等一系列病變。細(xì)胞變性、死亡是導(dǎo)致許多心臟疾病終末期表現(xiàn)和衰竭的重要機制，一些研究初步證實酒精導(dǎo)致細(xì)胞變性和死亡[1-3]。其原理可能是免疫反應(yīng)和酒精直接損害心肌細(xì)胞是造成ACM的主要因素，對ACM的發(fā)生發(fā)展起著十分重要的作用。ACM的心肌損傷程度主要取決于細(xì)胞因子，這些因子包括TNF-a、MDA 等。

1 資料與方法

1.1一般資料 雄性Wistar大鼠由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物科提供，體重為（180±10）g。利用放射免疫分析法檢測血清TNF-a的水平，用硫代巴比妥酸（TBA）法測定血清丙二醛（MDA）的含量。

1.2大鼠ALD模型制造和取材 Wistar大鼠隨機分為兩組，模型組44只給予40%酒精（8g/kg.d）分二次灌胃共12w，對照組22只給予等量的生理鹽水灌胃。實驗第8，12w末分別處死22只動物，心臟采血，取心臟 一部分10% 中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。另一部分用4%戊二醛保存送電鏡室作電鏡標(biāo)本，試驗?zāi)Ｐ蛥⒄瘴墨I[4]。

1.2血清TNF-a的測定

1.2.1試劑配制 ①125I-TNF1瓶（凍干品）：低溫保存，用前加緩沖液100ml；②TNF抗體1瓶（凍干品）：用前加緩沖液12ml；③TNF標(biāo)準(zhǔn)品5瓶（凍干品）：用前每瓶加緩沖液1.5ml，其濃度為：0.3， 0.9， 2.7， 8.1， 24.3ng/ml；④免疫分離試劑1瓶（懸浮液）：用前充分搖勻；⑤緩沖液1瓶。

1.2.2將-70°保存的血清恢復(fù)至室溫。復(fù)融混勻，4℃3000rpm離心，取上清液測定。

1.2.3測定 采用平衡法，取聚苯乙烯試管編號，按表1操作。

1.2.4計算結(jié)果 由自動γ計數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出有關(guān)參數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。

1.3丙二醛的測定 原理：過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰。方法：血清中MDA測定按下列步驟進行，見表2。

按下列公式計算：

MDA含量（nmol/ml）=■×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10nmol/ml）

×樣本測試前稀釋倍數(shù)

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P<0.05為提示兩者之間有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1一般情況 對照組大鼠毛發(fā)光量，動作靈活，食欲和大便正常，無溏便；模型組大鼠隨著進食酒精的時間延長，毛發(fā)越無光澤，食欲減退，體重增長緩慢，數(shù)只大鼠先后出現(xiàn)溏便。在白酒灌胃后，出現(xiàn)精神萎靡，行動遲緩，上述現(xiàn)象可于3～4h后緩解。

2.2心臟肉眼觀察 模型組心臟心外膜下可見白色點狀、條索狀或斑塊狀病灶，隨著進食酒精的時間延長，癥狀逐漸加重。

2.3心肌組織病理改變 8w模型組可見心肌局灶性變性壞死，伴淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞浸潤，部分可見壞死灶；12w可見較多心肌壞死病灶，可見程度不等的纖維化。

2.4心肌病變的電鏡觀察 模型組可見線粒體腫脹，嵴斷裂甚至空泡樣變，肌漿網(wǎng)擴張，肌絲溶解斷裂，肌原纖維破壞，并可見淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞浸潤。

實驗8w末模型組血清TNF-a，MDA值升高與對照組比較差異顯著（P<0.05），12w末模型組TNF-a，MDA值進一步升高與對照組存在顯著性差異（表3）。

2.5血清TNF-a的變化： 模型組血清TNF-a水平與對照組相比經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有顯著的差異（P<0.05 見表3）。

2.6模型組大鼠血清MDA含量和對照組相比明顯增高，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析兩組之間有顯著的差異（P<0.05），并與TNF-a水平之間也有相關(guān)性（r=0.465， P<0.05）。

3 討論

酒精是一簡單的碳水化合物，飲用后以單純擴散方式很快吸收，濃度越高吸收越快。整個胃腸道均能吸收酒精，但以小腸吸收為主，腦、肝臟、心臟是酒精作用的主要靶器官。在體內(nèi)，酒精首先代謝為毒性產(chǎn)物乙醛，后者在肝臟中很快被其脫氫酶氧化成乙酸鹽，因而難以在體內(nèi)蓄積。乙酸鹽轉(zhuǎn)運出肝臟外組織中進一步代謝。由于酒精能誘導(dǎo)酒精代謝酶的產(chǎn)生因而短期飲酒即能使人和動物產(chǎn)生耐受現(xiàn)象，表現(xiàn)為作用下降或作用時間縮短。

TNF-α可能通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)乙醇代謝相關(guān)酶的活性，加強乙醇代謝，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺氧、損害，伴隨心肌細(xì)胞內(nèi)過氧化反應(yīng)加強，抗過氧化能力的消弱。TNF-α具有直接的心肌損傷作用，它與心肌細(xì)胞膜上的TNF受體結(jié)合進入心肌細(xì)胞內(nèi)，與線粒體等細(xì)胞器結(jié)合，激活某些蛋白酶并使磷脂酶A活性升高，自由基生成增加，引起心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致心肌細(xì)胞變性壞死。TNF-α通過負(fù)性肌力作用、誘導(dǎo)心室重塑、促發(fā)心肌細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)CHF惡病質(zhì)的發(fā)生等多種途徑參與了CHF的發(fā)生和發(fā)展[5]。

自由基是指最外層軌道上有未配對電子的原子、分子、離子或基團，其化學(xué)活性高，不穩(wěn)定，具有較強的氧化能力。研究證實，自由基廣泛存在于各種生物體系中。自由基與人類疾病關(guān)系密切，正常情況下體內(nèi)存在消除自由基的各種酶類和非酶類系統(tǒng)，使自由基的產(chǎn)生和清除處于相對平衡狀態(tài)。當(dāng)這種平衡一旦失調(diào)時導(dǎo)致自由基含量增加，引起機體新陳代謝紊亂及一系列自由基鏈鎖反應(yīng)加劇，導(dǎo)致RNA、DNA、蛋白質(zhì)、酶和生物膜的氧化和過氧化損傷，從而引起多種病理過程和疾病的發(fā)生。乙醇、內(nèi)毒素、炎性反應(yīng)、免疫損傷等因素均可使體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生過多，自由基可損傷心肌細(xì)胞，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞。人體攝入的90%以上乙醇在肝內(nèi)主要通過ADH、MEOS、過氧化物酶等代謝途徑氧化，其代謝產(chǎn)物乙醛及MDA與多種機體蛋白結(jié)合導(dǎo)致其蛋白的結(jié)構(gòu)改變，功能發(fā)生障礙引起心肌損傷[1，5，6]。細(xì)胞漿和線粒體內(nèi)谷胱甘肽的衰竭程度決定細(xì)胞是發(fā)生壞死還是凋亡。實驗組大鼠血清MDA的含量較對照組明顯增高（P<0.01），表明長期攝入酒精可使體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生增多，發(fā)生了明顯的過氧化反應(yīng)。

本實驗結(jié)果表明血清MDA和TNF-a同心肌損害的相關(guān)性與文獻報道一致[1，5]。進一步證實其在ACM形成的過程中起重要作用。

參考文獻：

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[6]Arteel GE.Oxidants and antioxidants inalcohol-induced liverdisease.Gastroenterology，2003，124：778-790.

編輯/哈濤