視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞體外培養(yǎng)研究

摘要：Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中有著重要作用的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，針對該細(xì)胞的體外培養(yǎng)國內(nèi)外也做了大量的工作，本文就目前視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的體外培養(yǎng)、分離、鑒定、純化等方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：視網(wǎng)膜；Müller細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)

Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中最主要和最重要的膠質(zhì)細(xì)胞，參與了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及神經(jīng)遞質(zhì)的運輸、攝取和代謝[1]。因而Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的生長、損傷、修復(fù)和再生中起到重要的作用，是引起多種眼底疾病甚至導(dǎo)致失明的原因之一[2，3]。現(xiàn)今對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的研究也經(jīng)越來越受到重視，努力探尋一種最有效的體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的方法，以便更好的研究視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的功能及作用成為熱點之一。

1培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿的預(yù)處理

視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞在體外能更好的培養(yǎng)生長，常常需要對培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿進(jìn)行包被預(yù)處理，這樣有利于視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞的貼壁生長，常用的包被物有鼠尾膠原、層黏連蛋白、多聚氨基酸等[4，5]。

1.1鼠尾膠原包被法 參照我國學(xué)者任海濤等[6]的方法，通過對SD大鼠鼠尾進(jìn)行剝離取得鼠尾腱，用Tris-HCl 緩沖液、胃蛋白酶處理后獲得鼠尾膠原蛋白原液、然后反復(fù)進(jìn)行分級鹽析、復(fù)溶得到鼠尾膠原蛋白。使用時用高純度蒸餾水稀釋成0.1mg/ml的質(zhì)量濃度，再以50ul/cm2的量均勻涂抹覆蓋于培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿的全部底層表面，然后再室溫靜置放30min左右。吸除多余的的液體，予少量的滅菌蒸餾水洗滌，然后將水吸凈即可。

1.2層黏連蛋白和多聚氨基酸包被法 用1ug/ml的層黏連蛋白或者0.1mg/ml的多聚氨基酸直接加入培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿蓋過內(nèi)底板于37℃過夜[7]。或者先用多聚氨基酸包被2h，37℃，然后再吸凈，然后加入層粘連蛋白覆蓋全部底層表面，然后37℃過夜。吸凈液體即可。

1.3我國學(xué)者趙麗萍等[8]得出各種支持物的效果大小依次為人羊膜上皮面、鼠尾膠原、多聚鳥氨酸、板素、纖維連接蛋白、人羊膜基底面、Ⅰ型膠原。但是因為羊膜的透明度比較差，在顯微鏡下難以辨認(rèn)培養(yǎng)細(xì)胞的輪廓，實際使用比較少，而鼠尾膠原、多聚氨基酸膠原透明，操作簡單，故常被首選使用。

2培養(yǎng)基

2.1含血清培養(yǎng)基 血清含有細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長。血清可以增強(qiáng)視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在體外的存活率。

2.2無血清的合成培養(yǎng)基 無血清培養(yǎng)基按照細(xì)胞組分及濃度的差別，分為許多種類。馬偉等使用無血清培養(yǎng)基（NeurobasalTM-A Medium）成功培養(yǎng)出視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞[9]。

3材料來源

在視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，眼球的來源主要選取哺乳動物如狗、樹鼩[10]、兔、豬、鼠、猴、貓、人等。在實際實驗中，人的眼球是最好的研究對象，但材料來源有限，而且涉及倫理學(xué)方面的問題，因而非常難得。鼠的大體解剖和人相似，大腦比較發(fā)達(dá)，新陳代謝較其他動物更接近人，價格比較適宜，被大多數(shù)學(xué)者作為取材對象，一般選取小于1w內(nèi)的幼鼠[11，12]。

4視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的培養(yǎng)方法

4.1組織塊培養(yǎng)法 在無菌條件下，將SD乳鼠斷頭處死，取出眼球，用含慶大霉素和青霉素的PBS液浸泡，在解剖顯微鏡下距鋸齒緣1mm處剪開眼球，去除玻璃體及眼前節(jié)，剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜組織，將其剪成大小約2mm×2mm的視網(wǎng)膜組織，將其接種于培養(yǎng)瓶中，貼壁后加入含胎牛血清的培養(yǎng)基，放置于37℃含95%的氧氣和5%的二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[13]。

4.2酶解法 在無菌條件下，將SD乳鼠斷頭處死，取出眼球，用含慶大霉素和青霉素的PBS液浸泡，在解剖顯微鏡下距鋸齒緣1mm處剪開眼球，去除玻璃體及眼前節(jié)，剝?nèi)〕鲆暰W(wǎng)膜組織后，將其剪成大小約1mm×1mm的視網(wǎng)膜組織，加入消化酶，放置于37℃含95%的氧氣和5%的二氧化碳的培養(yǎng)箱中消化成單細(xì)胞終止消化，在1000r/min，4℃的條件下離心5min，棄上清。加入培養(yǎng)液，吹打成懸浮液，然后移入培養(yǎng)瓶中，放置于37℃含95%的氧氣和5%的二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[13]。

5視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞鑒定的方法

5.1倒置相差顯微鏡下觀察 早期視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，具有比較典型的形態(tài)學(xué)特征： 胞體較大，略呈長梭形，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核大，位于細(xì)胞中央或偏位，多呈橢圓形，有2個或2個以上的核仁，細(xì)胞有粗大突起[14]。但由于后期細(xì)胞形態(tài)變化大，因此不宜作為細(xì)胞鑒定的方法。

5.2透射電鏡鑒定 Mano T等[15，16]把透射電鏡下細(xì)胞內(nèi)含直徑為8～10nm的微絲作為Müller細(xì)胞的標(biāo)志。

5.3免疫組織化學(xué)鑒定 常用的鑒定方法：一般認(rèn)為該細(xì)胞對膠質(zhì)細(xì)胞纖維酸性蛋白（GFAP）、波紋蛋白（vimentin）、碳酸酐酶C、谷氨酞胺合成酶（GS）和S抗原（S-100）呈陽性反應(yīng)[17-20]。

6視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的純化

利用Müller細(xì)胞在細(xì)胞比重、貼壁時間、粘著力、細(xì)胞壽命等方面特性，我國學(xué)者歸納純化Müller細(xì)胞的方法主要有：神經(jīng)細(xì)胞的自行消亡，高濃度血清對血管內(nèi)皮的抑制作用，毛吸管吸取法，機(jī)械振蕩吹打法、速率沉淀法、梯度離心法等[21]。但由于毛吸管吸取法、速率沉淀法、梯度離心法等操作繁瑣、且不易被掌握，機(jī)械震蕩吹打法來基礎(chǔ)上改良的恒溫?fù)u床震動分離法、分次貼壁和反復(fù)消化法等被多數(shù)學(xué)者采用以純化Müller細(xì)胞。

7問題與展望

目前國內(nèi)外對Müller細(xì)胞研究比較多，但我們對其的了解還是比較少，視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞具體功能有哪些，當(dāng)眼底病變其增殖分化時具體的機(jī)制是什么等問題還不是特別清楚。隨著對Müller細(xì)胞的認(rèn)識不斷增加，相信在不久的將來在治療視網(wǎng)膜神經(jīng)元等相關(guān)疾病方面有著重要的應(yīng)用價值。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ransom BR， Orkand RK. Glial-neuronal interactions in non-synaptic areas of the brain：studies inthe optic nerve[J]TrendsNeurosci，1996，19（8）：352-358

[2]Raivich G， Bohatschek M， Kloss CU， et al. Neuroglial activation repertoire in the injured brain：graded response，molecular mechanisms andcues to physiological function[J]Brain Res Brain Res Rev，1999，30（1）：77-105

[3]Shatz C J， O'leary DD. Repair and replacement to restore sight.Report from the Panel on Ganglion Cell/Connectivity[J]Arch Ophthalmol，1993，111（4）：472-477

[4]Carri NG， Rubin K， Gullbergd， et al. Neuritogenesis on collagen substrates.Involvement of integrin-like matrix receptors in retinal fibre outgrowth on collagen[J]IntJDev Neurosci，1992，10（5）：393-405

[5]SEIL FJ. The extracellular matrix molecule，laminin，induces purkinje cell dendritic spine proliferation in granule cell depleted cerebellar cultures[J]Brain Res，1998，795（1-2）：112-120

[6]任海濤，鐘志勇，鄭佳琳，等.鼠尾膠原蛋白提取、分離、純化方法的建立及鑒定[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2012（11）：51-53.

[7]司徒鎮(zhèn)強(qiáng).細(xì)胞培養(yǎng)[M].西安：世界圖書出版社，2004：150-153.

[8]趙麗萍，周明華.雞胚前腦細(xì)胞在各種支持物特別是人羊膜基膜上生長的定量研究[J].解剖學(xué)報，198901）：56-60，127.

[9]馬偉，羅燕，李濤，等.體外無血清培養(yǎng)新生SD大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞[J].眼科新進(jìn)展，2011（12）：1111-1114.

[10]Sarafian TA， Montes C， Imura T， et al. Disruption of astrocyte STAT3 signaling decreases mitochondrial function and increases oxidative stress in vitro[J]PLoS One，2010，5（3）：e9532

[11]Qian JA， Bull MS， Levitt P. Target-derived astroglia regulate axonal outgrowth in a region-specificmanner[J]Dev Biol，1992，149（2）：278-294

[12]Mccarthy KD， De Vellis J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebraltissue[J]J Cell Biol，1980，85（3）：890-902

[13]Wakakura M， Foulds WS. Immunocytochemical characteristics of Muller cells cultured from adult rabbit retina[J]Invest Ophthalmol Vis Sci，1988，29（6）：892-900

[14]Limb GA， Salt TE， Munro PM， et al. In vitro characterization of a spontaneously immortalized human Muller cell line （MIO-M1）[J]Invest OphthalmolVis Sci，2002，43（3）：864-869

[15]Mano T， Puro DG. Phagocytosis by human retinal glialcells in culture[J]Invest Ophthalmol Vis Sci，1990，31（6）：1047-1055

[16]王越暉，宋鄂，冷瀛，etal.兔視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞原代培養(yǎng)[J].吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2003（03）：367-369.

[17]茍琳，張作明，許漢鵬.視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜病變中的作用和研究現(xiàn)狀[J].眼科研究，2003，21：217-220.

[18]田春雨，陰正勤.Müller細(xì)胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)元再生[J].軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報，2006，27：475-476.

[19]江雪豐，周希瑗.Müller細(xì)胞在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的研究進(jìn)展[J].眼科新進(jìn)展，2006（10）：796-798.

[20]Lewis GP， Erickson PA， Kaska DD， et al. An immunocytochemical comparison of Muller cells and astrocytes in the cat retina[J]Exp Eye Res，1988，47（6）：839-853

[21]劉瑤.視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的培養(yǎng)[J].國外醫(yī)學(xué).眼科學(xué)分冊，1995（01）：43-45.

編輯/申磊