甲狀腺相關性眼病動物模型的研究進展

摘要：甲狀腺相關眼病（ thyroid- associated ophthalmopathy， TAO）是一種器官特異性自身免疫性疾病，為細胞免疫和體液免疫在遺傳因素、環境因素條件下共同作用的結果，居成人眼眶病中發病率之首。建立一種理想的動物模型將為研究 T AO的發病機制和治療手段提供良好的平臺。已有學者采用人促甲狀腺激素受體活化的脾細胞免疫同源 BALB/c小鼠建立TAO動物模型。到目前為止，各種動物模型有其各自的優勢和劣勢，從不同模型中獲得的信息遠大于單一模型。

關鍵詞：甲狀腺相關性眼病；動物模型；研究方法

甲狀腺相關性眼病是一種與甲狀腺疾病相關的器官特異性自身免疫性疾病[1]。在環境與遺傳因素的相互作用下， 機體免疫系統產生了針對促甲狀腺激素受體（ Thyrotropin receptor， THSR ）的抗體（TRAb）。其中，刺激性抗體（TSAb）可模擬TSH 功能，導致甲狀腺激素過度分泌。其發病機制尚未闡明，治療也比較棘手。TAO是一種自身免疫性疾病，而自身免疫性疾病的基本特征之一就是用致敏的淋巴細胞可使疾病被動轉移，并能在動物身上復制出與人類自身免疫性疾病相似的動物模型[2]。理想動物模型的建立向來是深入研究疾病的發病機制，探索有效治療措施的途徑之一。本文對 TAO動物模型相關的文獻進行綜述。

1 理想的TAO動物模型的特點

TAO 各方面表現可通過不同方式誘導。對于一個理想的 TAO模型，應具備如下幾個或所有特征：①血清中總甲狀腺激素水平升高或促甲狀腺激素水平降低；②存在有活性的促甲狀腺素受體抗體，至少有促甲狀腺激素結合抑制性免疫球蛋白，即甲狀腺刺激性抗體；③甲狀腺有相應的病理改變；④具有甲亢的臨床特征，如體重降低；⑤類似于TAO 的眼部改變，如眼外肌結構的破壞、水腫、淋巴細胞浸潤和眶脂肪堆積。

眼眶組織的病理檢查發現：水腫、淋巴細胞浸潤和黏多糖改變主要發生在眶脂肪和淚腺組織。這種致突眼方法可能是使大量甲狀腺抗原，包括TSHR釋放入循環，打破免疫耐受，啟動眼眶自身免疫反應，導致淋巴細胞浸潤和眼眶水腫[3]。此外，高水平的循環TSH，包括內源性的和垂體提取物，都能刺激脂肪形成，導致隨后的眶脂肪堆積。

2 建立TAO動物模型的方法學進展

2.1單純TSHR免疫 采用人工合成 TSHR多肽誘導，或用細菌產生重組 TSHR的融合蛋白，即將 TSHR的胞外區（ECD）與麥芽糖結合蛋白（MBP）聯結成為ECD-MBP融合蛋白后免疫動物；利用桿狀病毒群將TSHR胞外部分的基因轉入昆蟲細胞，純化后獲得TSHR-ECD多肽，來免疫動物。

2.2 TSHR核酸免疫 核酸免疫是使真核細胞表達載體克隆出人類 TSHR的全長cDNA ，并將其注入小鼠脛骨前肌中獲得免疫。注射部位的肌肉細胞攝取cDNA后將蛋白產物表達于細胞表面。用含TSH受體cDNA的PBS和25%蔗糖制劑處理 NMR I雜合小鼠后小鼠的血清中均出現TRAb，其中部分雄鼠（9/30）表現為甲狀腺功能減退，部分（4/30）表現為甲亢，同時出現了類似人類TAO的眼部表現[4]。

2.3表達 TSHR的細胞免疫 利用表達人類 TSH受體和鼠 MHCⅡ類抗原分子的纖維母細胞免疫 AKR /N小鼠。經過 11～12w后，多數小鼠自發性死亡并伴有甲狀腺腫大。30%～40%實驗組小鼠的血清甲狀腺激素水平明顯高于對照組，并且在血清中發現具有刺激甲狀腺活性的TRAb。或用ECD-MBP或核酸免疫活化T細胞，再將活化的T細胞移植給同源BALB/c和NOD小鼠，16d后均出現類似于ECD-MBP免疫小鼠的甲狀腺炎，多數 BALB/c小鼠出現類似于TAO的眼眶組織病理學改變[5]。

2.4 TSAb轉基因 TSAb模擬TSH的功能可持續刺激甲狀腺，是導致甲狀腺激素過度分泌并出現甲亢臨床癥狀的關鍵。有學者發現，來自TAO患者的TSAb經過B細胞克隆后，同樣能結合 TSHR 并刺激甲狀腺，引起高功能表現。于是，他們把人的 TSAb基因轉入小鼠的受精卵中，培育出TSAb 轉基因小鼠。結果68 %的TSAb 轉基因小鼠出現T4升高伴TSH降低，20%T4升高伴TSH正常，T4和TSA b-IgM存在正相關關系[6]。組織學檢查發現有高功能分泌的表現，同時還發現TSA b-IgM-B 細胞的數量比預計的要低，提示B 細胞可能自我激活，發生了克隆剔除，這是免疫耐受的關鍵。

3 TAO動物模型的研究進展

多年來，研究者們嘗試建立TAO的動物模型，模擬出TAO的特征如體重減輕、甲狀腺腫等，更重要的是造成其眼球突出。人們認為采用接受\"長效甲狀腺刺激物\"如甲狀腺刺激抗體（ TSAB）的方法建立的動物模型不被認可。隨著對TAO的自身免疫性機制的逐漸認識，利用甲狀腺軸建立合適的 TAO動物模型的方案被認為是不可行的。

令人信服的TAO動物模型需要應用TSHR的克隆技術以及大量用于免疫反應的受體[6]研究者嘗試了很多誘導TAO的動物模型，包括用表達TSHR的B細胞或人類胚胎細胞293接種BALB/c鼠；用TSHR-cDNA的質粒作為載體接種雜交鼠；用腺病毒作為載體先接種樹突狀細胞，再接種到BALB/c鼠等。以上嘗試的共同點是均用表達TSHR的活體載體接種動物，以激發動物的免疫系統；另一個共同點是均需多次接種才能產生有活性的抗體。最近，研究者用B6B7抗體的可變區結合人類IgM的恒定區培養了TSAb2轉基因鼠TAO動物模型，其甲亢發病率達68%，并具有血T4和TSA b升高、TSH降低、甲狀腺腫大等特征。

目前的各種動物模型有著各自的優勢和劣勢。Shimojo模型具備很多GD的特征，但是這種模型僅局限于AKR/ N鼠種，并且其高甲狀腺素血癥和TSA b活性僅維持3個月，相對較短。用TSHR-c DNA的質粒可以接種不同種類的實驗鼠，并且其脾細胞可用于記憶T細胞應答性的體外研究，但是這種模型的重復性差，而且至少在BALB/c鼠種中，其甲亢發生率相對較低。腺病毒接種的實驗鼠具有和質粒實驗鼠相似的優勢，并且在不同試驗室間的可重復性較好，在BALB/c鼠種中甲亢發生率達50%，但是在C57BL/6鼠中僅25%發生甲亢，而在DBA/1J、DBA/2J、CBA/J和SJL/J鼠種中均未發生甲亢。

關于建立TAO動物模型的方法，Ludgate [7]認為以下方法值得推薦：①利用轉染了同源的 MHCⅡ類分子的細胞和人類或鼠類全長的 TSHR免疫AKR/N小鼠；②將TSHR活化的T細胞傳遞給同源的BALB/c小鼠；③用人類全長TSHR的核酸免疫NMR I雜合小鼠。

4 小結

綜上所述，目前在建立TAO動物模型的探索中已取得了一定的進展，但離建立完美的TAO動物模型仍有較大的距離。隨著對TAO發病的免疫學機制的認識，利用TSHR或其基因以及其他相關抗原來免疫動物的方法被多數學者接受。TSAb轉基因動物模型發育過程中伴隨了自身免疫的某些機制，如克隆剔除、對抗原的無反應以及對自身抗原耐受的突破，并且轉基因模型可進行傳代，避免了研究過程中需反復構建模型的麻煩，是一個全新的方向。TAO動物模型主要為鼠類，尚無精確評估測量活體鼠類動物模型的技術，另外鼠類體型小，缺乏硬性的眶緣，無法測量眼球突出度。Laitt等報道了吸入麻醉下抑脂 MRI 技術，可以很清楚地顯示眼外肌和眶脂肪，動態隨訪模型動物的眼病變化。建立可供研究與治TAO的合適的動物模型還有待于多方面的探索。

參考文獻：

[1]Barrett K， Liakata E， Rao PV， et al. Induction of hyperthyroidism in mice by intradermal immunization with DNA encoding the thyrotropin receptor.Clin Exp Immunol，2004，136：413-422.

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[7]Heufelder AE. Pathogenesis of ophthalmopathy in autoimmune thyroid disease.Rev Endocr Metab Disord 2000；1（12）：87-95.編輯/哈濤