早產胎盤組織中差異表達基因的研究

孫 健，汪 云，陶建英，陳 瑛(南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院產科，蘇州 500;南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院新生兒科;通訊作者，E-mail:cyandzh@sohu．com)

早產是指妊娠不足37周而分娩［1］，是一種常見、重要且復雜的妊娠并發(fā)癥，能顯著增加產褥期并發(fā)癥以及新生兒的各種疾病和病死率，約75%的圍產兒死亡與早產有關［2］。全世界每年約1 490萬早產兒降生，約占總新生兒的11．1%，而且比例有不斷上升的趨勢［3］。目前研究認為，早產是多種因素相互作用所致的一種綜合征，年齡、孕產史、不良行為、感染、遺傳因素、炎癥、宮縮和子宮頸長度等與早產相關［4，5］，但是早產發(fā)生的確切機制還不明確。隨著芯片技術的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)基因的異常表達是引起早產的重要原因。Chim等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，孕晚期母親血清中基因的差異表達導致早產。而有關早產胎盤中基因表達譜的研究還很少，所以本研究應用基因芯片技術通過對早產的胎盤組織及足月產胎盤組織進行基因表達譜的檢測及qRT-PCR驗證，旨在篩選及確定與早產相關的基因，從而為早產的預防、診斷提供新的分子標志物。

1 材料與方法

1．1 材料來源與分組

選擇2013-02～2013-10在南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院產科常規(guī)產前檢查并且早產的早產兒16例為病例組，參照第7版《婦產科學》診斷標準，選取同期的健康足月產兒20例為對照組，獲取兩組胎盤組織作為研究材料。兩組均為單胎妊娠，年齡20-40歲的初產婦或經產婦，排除原發(fā)性高血壓、腎病、糖尿病、心臟病、前置胎盤等內外科疾病及產科并發(fā)癥，兩組孕婦詳細情況見表1。所有孕婦均已簽署知情同意書，方案通過南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院倫理委員會批準。

表1 兩組孕婦及其新生兒一般情況比較Table 1 Comparison of general data of pregnant women and neonates between two groups

1．2 胎盤標本采集

標本采集于胎盤娩出后5 min內迅速完成。于胎盤胎兒面，避開鈣化點，在胎盤不同區(qū)域剪取數(shù)塊胎盤組織，每塊約1 cm見方，經DEPC(焦碳酸二乙酯)處理過的PBS漂洗2次，在濾紙上去除水分，分裝于凍存管內，迅速置于液氮中速凍后轉入-70℃冰箱保存。

1．3 總RNA的提取

采用總RNA抽提試劑盒(QIAGEN’s RNeasy)，參照生產商的步驟提取胎盤組織總RNA。用分光光度計Nano Drop ND-1000測定RNA的濃度和純度，通過瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測RNA質量，RNA中無DNA、無蛋白質污染、無明顯降解，可用于基因芯片檢測及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)實驗。

1．4 基因芯片的雜交、清洗及掃描

病例組中隨機選取9例，對照組中隨機選取4例進行基因芯片分析，采用芯片為GeneChip Primeview Human Gene Expression Array(Affymetrix公司)。每例樣本取500 ng總RNA，使用IVT express kit(Affymetrix公司)擴增標記 cRNA，取15 μg標記好的cRNA，配制成 cocktail，加入芯片中于 Hybridization Oven 640(Affymetrix公司)中45℃雜交16 h，雜交好的芯片在FS450全自動洗滌工作站(Affymetrix公司)上洗滌染色，用GeneChip?scanner7G(Affymetrix公司)掃描芯片并通過AGCC軟件得到原始數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)導入Expression Console軟件(Affymetrix公司)得到質控數(shù)據(jù)。

1．5 芯片數(shù)據(jù)分析

采用商業(yè)軟件Partek GS 6．5進行數(shù)據(jù)比對分析，去掉弱信號(信號值＜400)后，用各個樣本雜交信號值的中位值進行歸一化處理，篩選差異表達基因，采用國際上通用的基因功能分析法，即基因本體(gene ontology，GO)功能注釋分析法和KEGG通路分析法，對差異表達基因進行功能注釋與分析。

1．6 qRT-PCR 驗證

從芯片篩選到的差異表達的基因中，選擇可能具有一定臨床意義的基因在所有的樣本中進行qRT-PCR驗證(包括做基因芯片的樣本)。提取的每例樣本的總RNA通過HiScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme)逆轉錄成cDNA，應用AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix(Vazyme)在 ABI 7500熒光定量PCR儀上進行qRT-PCR。以磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)為內參，采用相對定量法分析病例組及對照組胎盤組織中基因mRNA的表達，使用2-ΔΔCt法分析所選基因的相對表達水平。

1．7 統(tǒng)計學分析

芯片結果采用統(tǒng)計軟件SPSS 11．7進行分析，組間差異采用t檢驗(two-tailed)，其中2倍以上變化，P＜0．05認為差異具有統(tǒng)計學意義。qRT-PCR實驗每組樣品均設3個復孔，至少重復3遍。采用統(tǒng)計軟件SPSS 11．7進行分析。計量資料以±s表示，組間差異采用t檢驗(two-tailed)，P＜0．05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 基因芯片結果

基因芯片包含了條36 000個轉錄本的信息，根據(jù)該芯片的結果，將病例組和對照組的表達譜進行對比，其中2倍以上變化并且差異有統(tǒng)計學意義認為是差異表達的基因。符合條件的基因共有75個，其中表達上調的有9個，表達下調的有66個。PSG9是上調倍數(shù)最多的基因，而LEP則為下調倍數(shù)最多的基因(見表2)，聚類分類圖見圖1。

圖1 4例對照胎盤組織和9例病例組胎盤組織差異表達基因聚類分析圖Figure 1 Cluster analysis of 75 differentially expressed genes in placentas from 4 control placentas and 9 preterm placentas

表2 基因芯片檢測的人早產胎盤差異表達基因Table 2 Differentially expressed genes in placental tissues of the preterm neonates detected by microarray

2．2 GO功能注釋分析以及KEGG通路富集分析結果

對75個差異表達基因分別進行GO功能注釋分析以及KEGG通路分析。GO功能注釋分析結果:差異表達基因主要參與抗原加工提呈、免疫應答、傷害應答和系統(tǒng)進程的調節(jié)等信號途徑，篩選出的GO功能注釋名稱及其基因數(shù)見表3。KEGG通路分析結果:將差異顯著基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中進行查詢，設定P＜0．05為顯著性標準，差異表達基因中有全身性紅斑狼瘡相關、哮喘相關、同種異體移植物排斥相關、移植物抗宿主相關等信號通路相關作用的基因，篩選出的生物學通路名稱及其基因數(shù)見表4。

表3 差異表達基因的GO功能注釋結果Table 3 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

表4 差異表達基因的KEGG通路及其基因數(shù)Table 4 KEGG pathways and gene numbers of differentially expressed genes

2．3 qRT-PCR驗證差異表達基因的結果

選取芯片中表達有差異的4個基因:妊娠特異性β-1糖蛋白9(PSG9)、促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、人妊娠相關血漿蛋白2(PAPPA2)和抑制素β-A(INHBA)，以磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)為對照基因，應用qRT-PCR技術在16例病例組胎盤和20例對照組胎盤中進行驗證。結果表明，PSG9基因在病例組胎盤組織中的表達水平顯著高于對照組，與對照組相比表達上調1．82倍;而CRH、PAPPA2和INHBA基因在病例組中的表達水平低于對照組，與對照組相比分別表達下調3．28倍、2．98倍和2．19倍，其結果與基因芯片技術檢測結果基本相符(見表5)。

表5 差異表達基因的qRT-PCR驗證結果(±s)Table 5 Confirmation of differentially expressed genes by RT-PCR(±s)

表5 差異表達基因的qRT-PCR驗證結果(±s)Table 5 Confirmation of differentially expressed genes by RT-PCR(±s)

基因 相對表達量對照組(n=20) 病例組(n=16)變化倍數(shù)P PSG9 2．05 ±1．21 3．73 ±1．54 +1．82 ＜0．05 CRH 0．92 ±0．63 0．28 ±0．13 -3．28 ＜0．01 PAPPA2 1．03 ±0．32 0．35 ±0．16 -2．98 ＜0．05 INHBA 0．55 ±0．37 0．25 ±0．14 -2．19 ＜0．05

3 討論

早產所致的圍生兒發(fā)病率、病死率以及后遺癥問題已成為一個世界性的衛(wèi)生問題，然而早產的病因、發(fā)病機制尚不明確，可能通過遺傳和環(huán)境的相互作用而發(fā)病，臨床上尚缺乏有效的對因防治措施［7］，因此找到早產的致病基因，從基因水平上預防治療早產十分重要。基因芯片檢測技術是鑒定疾病相關基因的有力工具［8］，在產科相關疾病中有著廣泛的應用［9，10］。本研究通過基因芯片技術從早產胎盤中鑒定出75個差異表達的基因，并對芯片中有顯著差異表達的4個基因(PSG9、CRH、PAPPA2和INHBA)擴大樣本量進行了qRT-PCR檢測，其結果與基因芯片技術檢測結果基本相符。

PSG9是妊娠特異性糖蛋白(PSG)家族中的一員，在GO功能注釋中參與防御應答，PSG是在人類懷孕期間母體血液中含量最豐富的滋養(yǎng)層蛋白質。有文獻表明低PSGs血清濃度與生長受限有關系［11］，部分文獻報道異常低濃度的PSGs與先兆子癇有關，但是也有研究表明異常低濃度的PSGs與先兆子癇沒有關系［11，12］，另外宮內孕和宮外孕PSGs的表達差異可以作為宮外孕臨床檢測的標記物［13］。但是PSG9與早產的關系還鮮有報道，我們的結果表明PSG9在早產胎盤樣本中表達上調，提示可能改變機體的防御應答功能，從而早產中可能發(fā)揮重要作用，有望成為早產預測的一個分子標記物。

CRH在GO功能注釋中參與激素分泌的調節(jié)、防御應答和炎癥應答。在子宮、胎盤和卵巢中高表達，被認為參與妊娠的蛻膜化，胚胎植入和正常的懷孕過程以及分娩的開始［14］。胎盤源的CRH循環(huán)水平在孕期接近分娩時呈指數(shù)級增加，顯示CRH可能是孕期長短的影響因素。與Mayor-Lynn等［15］的報道不一致，他們在5名早產胎盤和5名足月產胎盤中進行qRT-PCR驗證得出相對于足月產胎盤，CRH在早產胎盤中過度表達。不一致的原因可能與個體差異和樣本量有關，他們一共10例，我們36例。我們的結果發(fā)現(xiàn)CRH在早產胎盤中表達下調，可能改變了機體的激素分泌的調節(jié)、防御應答或炎癥應答功能，提示CRH在胎盤中表達下調可能與早產的發(fā)生有關。

PAPPA2在GO功能注釋中參與生長的調節(jié)。在人類胎盤中高表達，通過水解活性裂解胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBPs)，PAPPA2裂解IGFBP5和可能裂解IGFBP3，因此調節(jié)胰島素樣生長因子的釋放，以促進胎兒胎盤的生長。有研究表明，PAPPA2在胎盤中的異常表達可能與孕期并發(fā)癥有關，PAPPA2蛋白在孕婦的外周血中可以檢測到，因此可以用來作為胎盤異常的標記物［16］。我們的研究結果表明PAPPA2基因在早產胎盤中低表達，可能抑制胎盤的生長，從而在早產中起作用，有望成為早產預測的一個分子標記物。

INHBA在GO功能注釋中參與生長的調節(jié)、防御反應和激素分泌的調節(jié)。與α亞單位一起由二硫鍵結合而成抑制素A，抑制素A是一種異源二聚體糖蛋白，絕大多數(shù)學者認妊娠早期胎盤是抑制素A的主要來源，影響著妊娠的發(fā)生、發(fā)展及胎兒的生長發(fā)育。研究表明胎盤中INHBA的表達與生長受限有相關性，并且在子癇前期患者的胎盤中差異表達［17］;Zahra 等［18］的研究表明，母親孕中期血清中抑制素A的升高容易引起早產，可以作為預測早產的標記物。我們的研究結果表明INHBA基因在早產胎盤中低表達，而在早產中的功能還需要進一步的功能研究。

本研究存在著一些不足之處。首先，本研究例數(shù)較少，雖然基因芯片檢測結果與許多文獻報道相符，但還需要更大樣本重復上述實驗，以更準確地了解早產胎盤的基因表達譜。其次，本研究僅篩選并驗證了早產的差異基因，但相關差異表達基因在早產中所起的作用還需要功能試驗闡明。

綜上所述，本研究采用基因表達譜芯片技術檢測到早產胎盤組織中存在異常表達的基因譜和信號通路，并用qRT-PCR技術驗證了部分差異表達基因，與基因芯片檢測的結果一致，這些結果為早產的后續(xù)研究提供了新的思路。

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