蕎麥黃酮和蕎麥糖醇對胰脂肪酶的抑制作用

楊 鵬，李艷琴*

蕎麥黃酮和蕎麥糖醇對胰脂肪酶的抑制作用

楊 鵬，李艷琴*

（山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006）

目的：了解蕎麥麩皮中活性成分抑制胰脂肪酶的活性。方法：以苦蕎麩皮醇提物（主要成分為蘆?。⒋继釟堅馕铮ㄖ饕煞譃樘J丁、槲皮素和異槲皮素的混合物）和甜蕎麩皮水提物（主要成分為蕎麥糖醇）為實驗材料，測定3 個樣品對胰脂肪酶的抑制作用，以市售胰脂肪酶抑制劑——奧利司他為參照；通過研究底物、抑制劑和酶的加入順序對抑制率的影響，初步確定醇 提水解物的抑制機理。結果：實驗材料對胰脂肪酶的抑制作用依次為奧利司他＞醇提水解物＞醇提物＞水提物，半數抑制濃度（IC50）分別為0.47、1.94、2.53、17.6 mg/mL；醇提水解物的抑制作用機理主要是通過苦蕎黃酮與底物相互作用，從而阻礙了底物與酶的作用，屬于競爭性抑制。結論：蕎麥黃酮（即醇提物和醇提水解物）對胰脂肪酶有抑制活性；醇提殘渣經高壓水解后更有利于其對胰脂肪酶的抑制作用；蕎麥糖醇（即水提物）在低質量濃度下抑制效果不明顯，在較高的質量濃度下則表現出抑制活性。

蕎麥黃酮；蕎麥糖醇；蘆丁；槲皮素；異槲皮素；胰脂肪酶；抑制劑

蕎麥是蓼科（Polygobaceae）蕎麥屬的藥食同源作物，有兩個栽培種：苦蕎（Fagopyrum tataricum）和甜蕎（Fagopyrum esculentum），其中苦蕎麩皮中黃酮含量高達7%以上[1]?？嗍w黃酮能促進脂肪細胞分化，具有降血脂、降血糖、抗腫瘤和減緩便秘等多種藥理活性[2-5]。蕎麥糖醇大量富集在甜蕎的胚胎和糊粉層，它們在腸道末端被細菌消化，釋放出D-手性肌醇，能有效地降低血糖、血甘油三酯水平[6-9]。

胰脂肪酶是由胰腺分泌并對人體內甘油三酯消化吸收過程起關鍵作用的酶[10]。利用脂肪酶抑制劑可有效抑制腸道中脂肪酶的活性，從而減少進入體內的脂肪代謝，是治療肥胖的有效策略[11-12]。目前已有文獻報道了大黃柳葉、荷葉等植物的黃酮抽提物具有降脂的功效[13-14]，但是關于蕎麥黃酮、蕎麥糖醇對胰脂肪酶的作用還鮮有報道。本實驗以苦蕎麩皮醇提物和甜蕎麩皮水提物為材料，研究了蕎麥黃酮（醇提物）和蕎麥糖醇（水提物）對胰脂肪酶的抑制能力，并與奧利司他進行比較，篩選出對胰脂肪酶抑制作用較高的成分，以期為充分利用蕎麥麩皮、合理開發(fā)蕎麥降脂功能食品提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

蕎麥麩皮提取物由山西省農業(yè)科學院農產品加工研究所提供[15]?？嗍w麩皮醇提物的主要成分：總黃酮含量為74.0%，其中86.5%是蘆丁，槲皮素和異槲皮素微量；醇提后殘渣經高壓水解得到醇提水解物，總黃酮含量為76.2%，其中，蘆丁、槲皮素和異槲皮素分別占60.6%、25.2%、13.5%；甜蕎麩皮水提物的主要成分為D-手性肌醇43.6%、肌醇2.9%。

胰脂肪酶、奧利司他、D-手性肌醇 美國Sigma公司；脂肪酶測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；實驗用水為超純水。

1.2儀器與設備

Shimadzu-UV2550型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Inolab精密pH計 德國WTW公司；Polyscience恒溫水浴鍋美國Polyscience公司。

1.3方法

1.3.1胰脂肪酶溶液配制及其活力測定

稱取20 mg胰脂肪酶，溶于10 mL0.1 mol/L的KH2PO4-K2HPO4緩沖液（pH 7.4）中，酶用量為2 mg/mL或4×10-5mol/L。胰脂肪酶活力測定利用脂肪酶測定試劑盒[16]。胰脂肪酶活力單位定義為：在37℃、pH 7.4條件下，每克胰脂肪酶每分鐘分解1μmol三油酸甘油酯為1個酶活力單位（U）。

1.3.2抑制劑與酶作用時間的確定

以醇提水解物為抑制劑，取4 mL、37 ℃預熱的底物溶液（由試劑盒提供的三油酸甘油酯），加入25μL4 mg/mL的醇提水解物和25μL2 mg/mL的胰脂肪酶溶液，立即混勻，測定不同反應時間胰脂肪酶活性，計算抑制率。

1.3.2 節(jié)，反應10 min，測定胰脂肪酶活性，計算抑制率。

1.3.3 蕎麥提取物對胰脂肪酶的影響

以不同質量濃度的蕎麥麩皮提取物為抑制劑，方法同

1.3.4 醇提水解物抑制胰脂肪酶作用機理的確定

底物溶液、醇提水解物和胰脂肪酶按下列3 種順序加入：反應體系1：底物溶液與醇提水解物混合后，加入胰脂肪酶溶液進行反應；反應體系2：底物溶液與胰脂肪酶混合后，加入醇提水解物進行反應；反應體系3：醇提水解物與胰脂肪酶混合后，再加入底物溶液進行反應。分別測定不同加入順序的脂肪酶活力，計算抑制率。

1.4抑制率計算

式中：A1、A2、A3、A4分別為無抑制劑組（酶和底物）、空白組（只有底物）、加抑制劑組（酶、底物和抑制劑）和對照組（抑制劑和底物）在420 nm波長處的吸光度。

2 結果與分析

2.1抑制劑與酶作用時間的確定

圖1 反應時間對抑制作用的影響Fig.1 Effect of reaction time on the inhibitory rate of lipase

由圖1可知，在0～10 min范圍內醇提水解物對胰脂肪酶的抑制率隨著反應時間的延長而逐漸增大，到10 min時抑制率達到最大值。隨后，抑制率略微下降、趨于穩(wěn)定。這表明在反應10 min時，醇提水解物對胰脂肪酶的抑制作用最大，繼續(xù)延長反應時間抑制效應也不會增強?？梢妼嶒灥淖罴逊磻獣r間為10 min。

圖2 醇提物、醇提水解物和奧利司他抑制胰脂肪酶活性的比較Fig.2 Inhibitory rates of pancreatic lipase by ethanol extract, hydrolysate and orlistat

圖3 水提物、D-手性肌醇抑制胰脂肪酶活性的比較Fig.3 Inhibitory rates of pancreatic lipase by water extract andD-chiro-inositol (DCI)

2.2蕎麥提取物對胰脂肪酶的影響由圖2、3可知，醇提物、醇提水解物、水提物對胰脂肪酶的半數抑制濃度（IC50）分別為2.53、1.94、

17.6 mg/mL?？嗍w醇提物經高壓水解后，對胰脂肪酶的抑制作用略微增強，而作為目前市場上最成功的胰脂肪酶抑制劑——奧利司他在同樣實驗條件下的IC50為0.47 mg/mL。對胰脂肪酶的抑制能力：奧利司他＞醇提水解物＞醇提物＞水提物。水提物和純品D-手性肌醇在低質量濃度下抑制效果不明顯，在較高的質量濃度下則表現出抑制活性。這一結果說明蕎麥提取物對胰脂肪酶的抑制作用主要是通過蕎麥黃酮來實現的，而蕎麥糖醇及其降解產物D-手性肌醇對胰脂肪酶的抑制作用較微弱。故推測D-手性肌醇可能是通過其他途徑來實現其降脂作用。

2.3 醇提水解物抑制胰脂肪酶作用機理的確定

圖4 反應物加入順序對抑制作用的影響Fig.4 Effect of the order of addition of reactants on the inhibitory rate of lipase

由圖4可知，反應體系1對胰脂肪酶的抑制率最高，反應體系3次之，反應體系2最小。這表明蕎麥醇提水解物對胰脂肪酶的抑制作用主要是通過苦蕎黃酮與底物相互作用，從而阻礙了底物與酶的作用，屬于競爭性抑制作用。

3 討論與結論

蕎麥麩皮作為蕎麥面粉加工過程中的副產品，一般用于畜禽飼料。蕎麥麩皮占籽粒干質量的11.5%～24%，且富含多種功能成分；苦蕎麩皮總黃酮含量約7.7%[17]，是種子含量的4～8 倍；甜蕎麩皮富含蕎麥糖醇，在人體內可被降解為D-手性肌醇。蕎麥被譽為“五谷之王”，三降食品（降血壓、降血糖、降血脂），因此，多食蕎麥麩皮對人體有很大的益處。但由于麩皮直接食用口感差、不易消化、功能成分不能發(fā)揮其有效的作用，故提取蕎麥麩皮有效成分、開發(fā)功能食品和藥品具有重要的應用前景。

目前，對黃酮成分降血脂作用的研究較多，但對其降脂機理的研究較少。大黃柳葉黃酮提取物能夠抑制高脂飼料引起的小鼠肥胖和脂肪肝，但無抑制胰脂肪酶活性的作用[13]；槐角總黃酮對高脂血癥大鼠脂代謝紊亂具有較好的調節(jié)作用[18]；玳玳果黃酮滴丸對大鼠高脂血癥有明顯的預防作用，并能夠阻止高脂血癥大鼠的肝臟脂肪變性[19]；苦蕎黃酮亦有明顯的降血脂作用[20]。本研究證明苦蕎黃酮（醇提物和醇提水解物）具有抑制胰脂肪酶的能力；且經高壓水解后，部分蘆丁轉化為槲皮素和異槲皮素，更有利于其提高抑制活性。盡管如此，醇提水解物的抑制活性最高也只達到82%，遠低于奧利司他100%的最高抑制活性，但抑制率未達極限，也可能是天然提取物較安全的一個原因。另外，實驗結果初步表明，苦蕎黃酮并不直接與胰脂肪酶作用，主要是與底物結合阻礙底物與酶的結合來達到抑制作用。

D-手性肌醇是一種胰島素受體的促敏劑，能夠消除周圍組織對胰島素的抵抗，從根本上調節(jié)機體的生理機能和代謝平衡，從而對糖尿病及其并發(fā)癥有顯著療效[21]。目前，D-手性肌醇和蕎麥糖醇是否具有降脂功能鮮有報道。本研究結果表明，蕎麩糖醇（水提物）和純品D-手性肌醇在低質量濃度下抑制胰脂肪酶效果不明顯，在較高的質量濃度下則表現出抑制活性。這說明甜蕎麩皮的水提物抑制肥胖可能是通過D-手性肌醇有效地促進胰島素的功能，來實現降低血糖、血甘油三酯水平等。

[1]LIU Benguo, ZHU Yongyi. Extraction of flavornoids from flavornoidrich parts in tartary buckwheat and identification of the main flavornoids[J]. Journal of Food Engineering, 2007, 78: 584-587.

[2]TIAN Hanying, ZHAO Wenjun, GUO Xudan, et al. Tartary buckwheat extracts regulate insulin sensitivity through IKKβ/IR/IRS-1/Akt pathway under inflammation condition in mice[J]. Journal of Food and Nutrition Research, 2014, 2(6): 321-329.

[3]GUO Xudan, MA Yujie, PARRY J, et al. Phenolics content and antioxidant activity of tartary buckwheat from different locations[J]. Molecules, 2011, 16(2): 9850-9867.

[4]QIN Peiyou, WU Li, YAO Yang, et al. Changes in phytochemical compositions, antioxidant andα-glucosidase inhibitory activities during the processing of tartary buckwheat tea[J]. Food Research International, 2013, 50(2): 562-567.

[5] 王靜霞,黃艷菲,趙小燕,等.蕎麥和商品苦蕎茶中總黃酮的含量測定[J].食品工業(yè)科技, 2013, 34(2): 58-60.

[6]WON S R, KIM S K, KIM Y M, et al. Licochalcone A: a lipase inhibitor from the roots ofGlycyrrhiza uralensis[J]. Food Research International, 2007, 40: 1046-1050.

[7]WANG Li, LI Xiaodan, NIU Meng, et al. Effect of additives on flavonoids,D-chiro-inositol and trypsin inhibitor during the germination of tartary buckwheat seeds[J]. Journal of Cereal Science, 2013, 58(2): 348-354.

[8]SUSANNA R, ELISE K, EILA J, et al. The glycaemic and C-peptide responses of foods rich in dietary fiber from oat, buckwheat and lingonberry[J]. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 2013, 64(5): 528-534.

[9]HU Yaohui, YU Yatong, PIAO Chunhong, et al. Methyl jasmonate and salicylic acid inducedD-chiro-inositol production in suspension cultures of buckwheat (Fagopyrum esculentum)[J]. Plant Cell, 2011, 106(3): 419-424.

[10]GARZA A L, MILAGRO F I, BOQUE N N, et al. Natural inhibitors of pancreatic lipase as new players in obesity treatment[J]. Planta Medica, 2011, 77(8): 773-785.

[11]MARRELLI M, LOIZZO M R, NICOLETTI M, et al.in vitroinvestigation of the potential health benefits of wild mediterranean dietary plants as anti-obesity agents withα-amylase and pancreatic lipase inhibitory activities[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2014, 94(11): 2217-2224.

[12]HOSSAIN P, KAWAR B, NAHAS M E. Obesity and diabetes in thedeveloping world: a growing challenge[J]. The New England Journal of Medicine, 2007, 356: 213-215.

[13] 許傳蓮,鄭毅男,韓立坤,等.長白山大黃柳葉黃酮類成分促進脂肪分解作用的研究[J].中國藥學雜志, 2005, 40(10): 753-756.

[14] 霍世欣,周陶憶,司曉晶,等.荷葉黃酮化合物對胰脂肪酶抑制作用的研究[J].天然產物研究與開發(fā), 2008(2): 328-331.

[15] 李艷琴,周鳳超,陜方,等.蕎麥麩皮提取物與α-葡萄糖苷酶的作用[J].食品科學, 2010, 31(17): 10-13.

[16] LI Yanqin,YANG Peng, GAO Fei,et al.Probing the interaction between 3 fl avonoids and p ancreatic lipase by methods of fl uorescence spectroscopy and enzymatic kinetics[J]. European Food Research and Technology, 2011, 233: 63-69.

[17]WANG Min, LIU Jiaren, GAO Jinming, et al. Antioxidant activity of tartary buckwheat bran extract and its effect on the lipid profile of hyperlipidemic rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57: 5106-5112.

[18] 王永紅,龍曉莉,何菲,等.槐角總黃酮對高脂血癥大鼠降血脂及抗氧化能力的實驗研究[J].第四軍醫(yī)大學學報, 2009, 30(22): 2677-2681.

[19] 邱紅鑫,陳丹,劉永靜,等.玳玳果黃酮滴丸對高脂血癥大鼠的降血脂作用研究[J].中國現代應用藥學, 2011, 28(7): 597-601.

[20] 李潔,梁月琴,郝一彬.苦蕎類黃酮降血脂作用的實驗研[J].山西醫(yī)科大學學報, 2004, 35(6): 570-571.

[21]YAO Yang, SHAN Fang, BIAN Junsheng, et al.D-Chiro-inositol enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(21): 10027-10031.

Inhibitory Effect of Flavonoids and Fagopyritols from Buckwheat on Pancreatic Lipase

YANG Peng, LI Yanqin*
(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Objective: To understand the inhibitory activity of bioactive components in buckwheat bran on pancreatic lipase, which can provide evidence to explain its mechanism for lowing serum lipids. Methods: Ethanol extract of buckwheat bran (mainly containing rutin) and high-pressure hydrolysate of the residue left after ethanol extraction (a mixture of quercetin, isoquercetin and rutin) were obtained from tartary buckwheat bran, while water extract (mainly consisting of fagopyritols) was prepared from common buckwheat bran for evaluation of their inhibitory activity on pancreatic lipase in comparison with the lipase inhibitor orlistat. The mechanism of the hydrolysate for inhibiting pancreatic lipase was investigated by examining the effect of the order of addition of substrate, inhibitor and enzyme on the inhibitory activity. Results: The sequence of inhibitory activity toward pancreatic lipase was orlistat ＞ hydrolysate ＞ ethanol extract ＞ water extract, with IC50values of 0.47, 1.94, 2.53 and 17.6 mg/mL, respectively. The inhibitory mechanism of the hydrolysate on pancreatic lipase belonged to the competitive type, which was mainly associated with the presence of flavonoids interacting with the substrate to block its interaction with the lipase. Conclusion: Buckwheat flavonoids present in the ethanol extract and the hydrolysate exert inhibitory effects on pancreatic lipase, especially those of the latter. Buckwheat fagopyritols in the water extract from common buckwheat bran show no inhibitory effect on pancreatic lipase at a low concentration, but can inhibit this enzyme at a high concentration.

buckwheat flavonoids; buckwheat fagopyritols; rutin; quercetin; isoquercetin; pancreatic lipase; inhibitor

TS201.2

A

1002-6630（2015）11-0060-04

10.7506/spkx1002-6630-201511012

2014-06-30

山西省科技攻關項目（20120311006-1）

楊鵬（1986—），男，碩士，研究方向為植物功能成分開發(fā)。E-mail：peng114011@163.com

*通信作者：李艷琴（1960—），女，教授，學士，研究方向為植物功能成分開發(fā)，微生物生態(tài)。E-mail：yanqin@sxu.edu.cn