云南芒果中酵母菌分離鑒定及在芒果酒發酵中的應用

岑 濤，岳田利*，袁亞宏，丁 旭，王虎玄，宋 靚

云南芒果中酵母菌分離鑒定及在芒果酒發酵中的應用

岑 濤，岳田利*，袁亞宏，丁 旭，王虎玄，宋 靚

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

本實驗以從云南省采集的4個品種的芒果果皮作為分離源，經分離、純化及三級篩選得到6株在芒果汁基質中具有良好發酵力的酵母菌。利用WL營養培養基對所篩得酵母菌進行初步分類，結合26S rDN A測序鑒定，除1株為Hanseniaspora opuntiae，另外5株均為Wickerhamomyces anomalus。其中DTM9（W. anomalu）和DKT11（H. opuntiae）發酵芒果酒的氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析結果表明，與芒果清汁相比，DTM9發酵的芒果酒中，酯類物質含量增加了51.63%，種類增加了400%；醇類物質含量增加28.37%，種類增加了27.27%；DKT11發酵的芒果酒中酯類物質含量增加了44.27%，種類增加了433%；醇類物質含量增加了34.17%。綜合比較理化指標和感官分析結果，DTM9具有更高的糖利用率，且發酵的芒果酒感官品質更優良，對提高芒果酒的香氣質量有重要意義。

芒果；酵母菌；分離鑒定；26S rDNA；揮發性成分

芒果被世界衛生組織稱為十大最佳水果之一[1]。由于其含有豐富的營養成分，受到人們的廣泛喜愛，在世界80多個國家地區生產[2-3]。在我國，僅2011年芒果產量就達到100.34萬t，總產值達38.9億元[4]。然而，我國芒果的銷售主要集中在中、低檔市場，以鮮食為主[5]，并且在采摘、運輸與貯藏過程中極易因機械損傷和微生物浸染等造成其腐爛變質，影響其品質，極大地限制了芒果的流通性[6]。另外，在芒果的主產區，隨著芒果種植面積的不斷擴大，種植區域無法消耗大量的鮮芒果，導致大量的芒果腐爛變質而被廢棄，不僅造成了資源的浪費和環境的污染，同時給廣大果農帶來巨大的經濟損失[7-9]。由于芒果中可溶性固形物含量為16%～20%，含糖量高達17%～20%，適合進行果酒發酵[10-12]，因此，改善日益嚴重的芒果資源浪費現狀的途徑之一就是利用成熟的果酒釀造技術進行芒果酒發酵，提高芒果的經濟價值和利用率，維護果農利益，促進芒果產業健康發展。國內關于芒果酒釀造的報道都是利用商業酵母作為發酵菌株，而利用來源于芒果的酵母菌進行芒果酒釀造還未見報道。

本研究以芒果的果皮作為分離源進行酵母菌的分離與純化，經過三級篩選得到適合釀造芒果酒的酵母。通過WL營養培養基對菌株的形態進行觀察及初步分類，結合26S rDNA測序和系統發育樹的構建對篩選菌株進行種屬鑒定。然后，分別將其用于芒果酒發酵，通過對不同菌株發酵的芒果酒香氣分析與感官評定篩選出性能優良的菌株并對其產香特性進行研究。

1 材料與方法

1.1材料與培養基

于2013年7—9月從云南省麗江市華坪縣采摘成熟度良好的凱特、熱農、海頓、湯米4個品種的芒果，裝入無菌袋中迅速帶回實驗室20℃控溫保藏一周后熟。

YPD培養基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L（固體培養基加入瓊脂粉20 g/L）。2,3,5-氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）培養基[13]：由上層培養基與下層培養基組成。其中TTC上層培養基：TTC 0.5 g/L、葡萄糖5 g/L、瓊脂15 g/L、現配現用；TTC下層培養基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏1.5 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、硫酸鎂0.4 g/L、檸檬酸0.3 g/L、瓊脂30 g/L。芒果汁培養基：以芒果為原料制備的清汁，糖度為16 °Brix，100℃滅菌30 min。

1.2儀器與設備

DPX-9002B-1恒溫培養箱上海福瑪實驗設備有限公司；pHS-3C酸度計上海虹益儀器廠；WYT阿貝折光儀泉州中友光學儀器有限公司；JA2003電子天平上海精密科學儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司；PTC0200聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司；Trace DSQ相色譜-質譜聯用儀美國熱電公司。

1.3方法

1.3.1酵母菌的分離與純化

在無菌條件下，分別取后熟完全的4個不同品種芒果果皮各10 g至盛有90 mL YPD液體培養基的250 mL三角瓶中，28℃、150 r/min搖床培養2～3 d。取1 mL培養液至9 mL無菌生理鹽水中搖勻，依次梯度稀釋，分別取合適梯度稀釋培養液100μL涂布于添加0.5%硫酸鏈霉素的YPD培養基平板上，28℃恒溫培養2～4 d。挑取具有典型酵母菌落特征的單菌落進行多次平板劃線，直至完全純化。將純化后的酵母菌種轉接到YPD斜面培養基上，28℃培養2～4 d后，置于4℃冰箱保存。

1.3.2酵母菌的篩選

1.3.2.1酵母菌的初篩

將分離純化的菌株活化后以6%的接種量接入YPD液體培養基中，于28℃、150 r/min搖床培養2 d。由8位有品評經驗的品評員（男性4名，女性4名）組成的感官評定小組對各菌株發酵液的氣味效果進行評價，淘汰發酵液氣味不愉悅和明顯異于正常釀酒酵母發酵液氣味（有明顯的酸味、臭味、刺鼻性氣味）的發酵菌株。

1.3.2.2酵母菌的三級篩選

一級篩選為利用TTC顯色法對初篩所得酵母菌株的產酒精能力進行測定[14]。挑取紅色菌落進入二級篩選。

二級篩選為利用杜氏管法通過觀察并記錄杜氏小管內菌株的產氣量對酵母菌株的起酵速度與發酵能力進行篩分。將一級篩選得到的菌株進行活化，以10%的接種量接入附有杜氏小管的芒果汁培養基中，在28℃恒溫箱中靜置培養2 d。每隔12 h觀察并記錄杜氏小管內的氣體高度。選取起酵速度快且發酵能力強的菌株進入三級篩選[15]。

三級篩選為利用杜氏管對酵母菌株在特定酒精度、糖度、SO2質量濃度芒果汁中的耐受性進行篩分。將自然糖度為16 °Brix的芒果汁培養基分別進行如下處理：1）加入無水乙醇使芒果汁中無水乙醇體積分數分別為5%、8%、10%；2）加入偏重亞硫酸氫鉀使芒果汁中SO2質量濃度為100 mg/L；3）加入蔗糖使芒果汁中糖度為20 °Brix。將二級篩選得到的菌株進行活化后以10%的接種量分別接入上述處理的芒果汁培養基中，以未做處理的16 °Brix芒果汁培養基為對照，于28℃恒溫箱中靜置培養2 d。每隔2 h觀察并記錄杜氏小管內的氣體高度。挑選對乙醇、糖、SO2耐受性好的菌株作為入選菌株。

1.3.3菌落形態初分[16]

將篩選得到的菌株接入YPD液體培養基中，28℃搖床活化24 h后，劃線轉接于WL營養培養基。28℃恒溫培養數天，觀察記錄各個菌落的形態與顏色。根據平板內菌落的形態和顏色對所得菌株進行形態初分。

1.3.4篩選菌株的分子生物學鑒定

采用26S rDNA D1/D2區序列分析對三級篩選得到的酵母菌株進行分子生物學鑒定[17]。

1.3.4.1測序菌株的DNA提取

采用OMEGA公司的E.Z.N.A.酵母DNA提取試劑盒，按其說明書方法進行測序菌株的DNA提取。

1.3.4.2菌株26S rDNA D1/D2區域的PCR擴增

PCR擴增引物為：通用引物NL1（5’-GCATATCAAT AAGCGGAGGAAAAG-3’）與NL4（5’-GGTCCGTG TTTCAAGACGG-3’）。

PCR反應體系（50μL）：DNA模板2μL，引物（NL-1/NL-2）各1μL，Premix Taq酶25μL，二甲基亞砜2.5μL，滅菌超純水18.5μL。

PCR循環程序為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min；52℃退火1 min；72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸5 min。

1.3.4.3 DNA測序

用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳確定PCR產物，將PCR所得產物送至北京華大基因科技股份有限公司測序。26S rDNA D1/D2區擴增產物的測序引物為NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）。

1.3.5 26S rDNA序列比對及系統發育樹構建

將測序所得26S rDNA片段的基因序列與GenBank在線數據庫中區域序列進行BLASET比對，并利用Mega 5.1軟件構建系統發育樹[18]。

1.3.6芒果酒的發酵和果酒感官及香氣成分分析

芒果酒加工工藝：芒果打漿→0.14%果膠酶，40℃水浴3 h→ 4 000×g離心5 min→芒果清汁調糖→28℃主發酵7 d→后發酵和陳釀→低溫放置→芒果酒[19]。

感官評定采用百分制法，感官評定小組由有品評經驗的品評員共17人（男性9名，女性8名）組成，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[20]與GB/T 10220—2012《感觀分析方法學總論》[21]相關內容，進行獨立品評，分別從色澤（10分）、透明度（10分）、香氣（30分）、滋味（30分）、典型性（20分）5個方向評分。酒樣的評定分數為各感官評定人員的各項評分均值之和，并以芒果清汁作為對照。同時，根據GB/T 15038—2006對芒果酒基本理化指標進行檢測，利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）進行芒果酒香氣成分的分析[22]。

色譜條件：色譜柱為DB-Wax彈性石英毛細管柱（30 m×0.52 mm，1μm），程序升溫40℃，保持2.5 min，以6℃/min升溫至230℃，保持7 min；進樣口溫度250℃，傳輸線溫度230℃，載氣為He，流速1.0 nL/min，采用不分流進樣。

質譜條件：電離方式EI，70 eV；離子源溫度200℃，質量掃描范圍為35～400 amu；發射電流100μA，檢測電壓1.4 kV。

1.4數據統計分析

GC-MS測定出的總離子流圖譜利用隨機Xcalibur工作站NIST2008標準譜庫自動檢索各組分質譜數據，同時與NIST Library和Wiley Library相匹配，僅當匹配度和純度大于800的結果才進行報道。以2-辛醇為內標物質，按峰面積歸一化法計算各組分相對含量[23]。本研究中每組實驗進行3次平行實驗，實驗數據以±s表示。

2 結果與分析

2.1酵母菌的分離與純化結果

從芒果果皮中分離得到具有典型酵母菌落特征的菌株共60株。對菌株進行編號，其中凱特芒果中分離得到13株，分別編號為DKT1～DKT13；熱農芒果中分離得到18株，分別編號為DRN1～DRN18；海頓芒果中分離得到15株，分別編號為DHD1～DHD15；湯米芒果中分離得到14株，分別編號為DTM1～DTM14。

2.2酵母菌的篩選結果與分析

2.2.1初篩結果

通過初篩，排除發酵液氣味明顯異于正常釀酒酵母發酵液氣味的22株酵母菌，保留38株菌株。通過TTC顯色反應篩選出18株菌落顏色為紅色或深紅色的菌株。部分菌株的顯色分類結果見圖1。

圖1 酵母菌株在TTC培養基中的顯色結果Fig.1 Yeast strains cultured in TTC chromogenic medium

2.2.2酵母菌的二級篩選結果

將18株初篩得到的菌株在附有杜氏小管的芒果汁培養基中培養，觀察產氣情況，結果見表1。發酵12 h后，有3株菌株沒有明顯的產氣情況，分別為DTM3、DRN9及DRN12，而DTM9的產氣量為杜氏小管體積的1/2，DTM1、DTM2的產氣量已達到杜氏小管體積的3/4，其余菌株也均已開始產氣。24 h后，有11株菌株的產氣量充滿或近似充滿杜氏小管；48 h后，共有13株菌株的產氣量完全充滿杜氏小管。篩除12 h還未開始明顯發酵以及48 h后產氣還未充滿杜氏小管的酵母菌株共5株，得到13株菌株進行后續篩選。

表1 酵母菌株在芒果汁培養基中的產氣情況Table 1 Gas production situation of yeast strains in mango juice medium

2.2.3酵母菌的三級篩選結果

表2 不同條件下酵母菌株的起酵時間Table 2 Fermentation starting time of yeast strains in different conditions

菌株在不同條件芒果汁培養基中培養的起酵時間如表2所示，培養48 h后的產氣情況如表3所示。由表2可知，與對照組相比，100 mg/L的SO2質量濃度條件下，除DKT11、DTM1、DTM7、DHD14這4株菌株的起酵時間不變外，其余菌株的起酵時間均推遲2 h或4 h；在20 °Brix的糖度條件下，有4株菌株起酵時間推遲了2 h，DRN10菌株推遲了4 h，DTM7菌株推遲了8 h，其余菌株沒變化。酒精度變化使大部分菌株起酵時間受到影響，尤其在酒精度10%條件下，所有菌株的起酵時間均受到了影響，DTM7、DKT6、DKT8、DKT11菌株的起酵時間推遲12 h以上，而DTM1、DRN10、DKT7不能耐受8%以上酒精含量。

表3 不同條件下酵母菌株的產氣情況Table 3 Gas production situation of yeast strains in different conditions

由表3可知，與對照組相比，20 °Brix糖度和100 mg/L SO2質量濃度條件下，各菌株產氣量未受影響或受到的影響不大。而5%酒精度條件下，DHD6、DHD14、DRN10、DKT7、DKT8只有微弱的產氣現象。酒精度8%與10%條件下，大部分菌株的產氣受到明顯的抑制。

綜合起酵時間與產氣量結果考慮，各菌株在不同條件下的耐受性差別較大。隨著酒精度的增加，各菌株的起酵時間與產氣量均受到了很大的影響。對20 °Brix糖度耐受性較差的菌株為DTM7，對100 mg/L SO2耐受性較差的菌株為DHD14，對5%酒精度耐受性較差的菌株為DTM7、DKT8、DHD6、DHD14、DRN10、DKT7，對8%酒精度耐受性較差的菌株為DTM7、DRN10、DKT8、DTM1、DKT7。絕大部分菌株不能耐受10%酒精度。綜合考慮，通過三級篩優選的菌株為DHD8、DRN6、DTM2、DTM9、DKT6與DKT11共6株菌株。

2.3酵母菌株菌落形態

表4 WL營養培養基鑒別結果Table 4 Identification of yeasts in WL culture medium

對篩選所得6株酵母菌株進行WL營養培養基培養，所得結果如表4所示。通過菌落形態和顏色觀察，初步判定DRN6、DKT6、DHD8這3株菌親緣關系較近，菌株DTM2和DTM9的親緣關系較近。而DKT11菌株的菌落形態及顏色與其余5株菌株完全不同，判斷其親緣關系較遠。

2.4 26S rDNA序列同源性分析及系統發育樹的建立

利用BLAST工具，將所篩選菌株測序結果與GenBank中已知標準菌株的26S rDNA序列進行比對，比對結果見表5。運用Neighbor-Joining法構建的系統發育樹如圖2所示。結果表明，菌株DKT11與H. opuntiae的親緣關系最近（100%）。其余菌株與W. anomalus的親緣關系最近（99%）。確定菌株DKT11是H. opuntiae，其余菌株均為W. anomalus。

表5 分離菌株與GenBank參考菌株的比對結果Table 5 Similarity of isolates with the reference strains from GenBank

圖2 芒果果皮酵母分離株26S rDNA序列系統發育樹Fig.2 Phylogenic tree based on the 26S rDNA sequences of yeasts from mango peel

2.5芒果酒釀造

由各菌株26S rDNA序列測序結果可知，DHD8、DRN6、DTM2、DKT6、DTM9親緣關系一致，都屬于W. anomalus，而DKT11為H. opuntiae。因此，從5株W. anomalus中隨機挑選DTM9菌株與漢遜酵母DKT11菌株作為出發菌株釀造芒果酒。分別測得兩株菌株發酵芒果酒的各項理化指標及感官得分，結果如表6所示。并進一步通過GC-MS對芒果原汁及DTM9、DKT11菌株所釀造的芒果酒中揮發性香氣成分進行檢測。總離子流譜圖分別如圖3～5所示。按照1.4節數據分析方法得出3種樣液中各揮發性香氣成分的相對含量，其中主要揮發性香氣物質含量的比較結果如表7所示。

表6 芒果酒的理化指標及感官評分結果Table 6 Chemical and sensory analysis of mango wine

由表6可知，兩種芒果酒樣中可溶性固形物及總糖含量與芒果原汁相比均有明顯的減少，說明DKT11和DTM9酵母都適合利用芒果汁進行發酵，DTM9發酵的芒果酒樣酒精度為4.5%左右，但是DTM9菌株具有更高的糖利用率，并且感官評分更高，說明DTM9菌株釀造的芒果酒具有更好的風味與口感。

圖3 芒果原汁SPME-GC-MS總離子流圖Fig.3 SPME-GC-MS total ion current of aroma components in mango juice

圖4 DKT11芒果酒SPME-GC-MS總離子流圖Fig.4 SPME-GC-MS total ion current chromatogram of aroma components in mango wine fermented by DKT11

圖5 DTM9芒果酒SPME-GC-MS總離子流圖Fig.5 SPME-GC-MS total ion current chromatogram of aroma components in mango wine fermented by DTM9

表7 各樣液中主要揮發性香氣物質含量的比較Table 7 Major volatile compounds of mango wine

果酒中對香味貢獻最大的成分是醇類物質、酯類物質以及酸類物質[24]，根據GC-MS檢測結果，從芒果酒發酵前后主要揮發性香氣成分種類及含量的變化（表7）可知，相較于發酵前，兩種不同種酵母發酵后的芒果酒中，酯類物質、醇類物質的種類及含量都有很大提高。其中DTM9酵母釀造的芒果酒中酯類物質從3種增加到15種，種類增加了400%，含量增加了51.63%；醇類物質含量增加了28.37%，種類增加了27.27%。DKT11酵母釀造的芒果酒酯類物質含量增加了44.27%，種類增加了433%；醇類物質含量增加了34.17%。此外，DTM9菌株發酵芒果酒香味成分中的桃金娘烯醇、金合歡醇、香葉醇賦予了芒果酒獨特的風味和口感[25]。結合兩種酵母發酵芒果汁的理化指標及感官評價可知，DTM9菌株有望開發成適合釀造低醇芒果甜酒的新型專用酵母。

3 結 論

從芒果果皮中共分離得到6株適合芒果汁發酵的酵母菌，通過26S rDNA序列的同源性分析和系統發育樹的構建，確定其中1株為H. opuntiae，其余5株均為W. anomalus。目前國內關于芒果酒釀造的報道主要集中于工藝的研究[6-7]，而以芒果為分離源得到適合釀造芒果酒的本土酵母的研究還未見報道。本研究以芒果作為來源分離酵母菌株，并將其應用于芒果酒發酵，得到口感及風味良好的低醇果酒。

利用分離得到的DTM9（W. anomalu）和DKT11（H. opuntiae）進行發酵，對發酵液的理化指標、感官品質及GC-MS的檢測結果表明，DTM9發酵的芒果酒中酯類物質含量增加了51.63%，種類增加了400%；醇類物質含量增加了28.37%，種類增加了27.27%。DKT11發酵的芒果酒中酯類物質含量增加了44.27%，種類增加了433%；醇類物質含量增加了34.17%。相較之下，DTM9比DKT11具有更高的糖利用率，且發酵所得芒果酒感官品質更優良。

本實驗篩選所得酵母菌的糖利用率雖略低于普通釀酒酵母，但發酵所得芒果酒的香氣成分豐富，感官品質優良，有望開發成為低醇甜型芒果酒發酵的新型專用酵母。此外，也為與釀酒酵母混菌發酵獲得醇、香兼備的芒果酒提供了理論依據，為芒果酒產業的發展提供了新的思路。

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Isolation and Identification of Yeasts in Mango from Yunnan and Their Application in Mango Wine Fermentation

CEN Tao, YUE Tianli*, YUAN Yahong, DING Xu, WANG Huxuan, SONG Jing
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

This experiment collected the peels of 4 mango varieties from Yunnan province of China as sources of yeasts. After separation, purificationand tertiary screening, 6 yeasts suitable for mango juice fermentation were obtained. The phylogenetic tree based on 26S rDNA sequence analysis was constructed for determining the genetic location. The isolate DKT11 was identified asHanseniaspora opuntiae, whereas 5 other isolates were identified asWickerhamomyces anomalus. DKT11 and DTM9 were subjected to further analysis. Physicochemical indexes and sensory evaluation showed that the two strains had good fermentation performance in mango juice to produce high-quality mango wines. The volatile aroma composition of the mango wines was analyzed by GC-MS. The results showed that the kinds and amounts of volatile aroma compounds in the wines were significantly improved when compared with those in mango juice. Specifically, the numbers of ester and alcohols in the wine fermented by DTM9 were increased by 400%and 27.27%, respectively, and the amounts of the two groups of compounds were elevated by 51.63%and 28.37%, respectively. The amount of ester and alcohols in the wine fermented by DKT11 was increased by 44.27%and 34.17%, respectively, and the number of esters was raised by 433%. Overall, these findings showed DTM9 had a higher sugar utilization rate and yielded a mango wine with better sensory quality, emphasizing its significance for improving the aroma quality of mango wine.

mango; yeast; isolation and identification; 26S rDNA; volatile compounds

TS261. 1

1002-6630（2015）11-0119-06

10.7506/spkx1002-6630-201511023

2014-08-14

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B01）

岑濤（1989—），女，碩士研究生，主要從事發酵工程研究。E-mail：centv1215@163.com

*通信作者：岳田利（1965—），男，教授，博士，主要從事食品生物技術及食品安全控制研究。E-mail：yuetl@nwsuaf.edu.cn