油脂體組成、結構及油脂體蛋白研究進展

胡 琪，郭詩文，呂 瑩，施小迪，郭順堂*

油脂體組成、結構及油脂體蛋白研究進展

胡 琪，郭詩文，呂 瑩，施小迪，郭順堂*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

油脂體是由中性脂質、環繞中性脂質的磷脂和嵌插在磷脂層中的蛋白組成的小球體，是植物油脂儲存的重要器官。油脂體中的蛋白對油脂體的獨立性、完整性起重要作用，并且在種子萌發過程中，能激活油脂體表面的相關酶類，從而促進代謝，為機體提供能量，促進植物的生長。本文綜述油脂體的組成、結構以及油脂體蛋白的結構、功能性質，為油脂體的利用和開發提供參考。

油脂體；油脂體蛋白；油脂體鈣蛋白；甾醇蛋白

油脂體是由一層磷脂膜包圍基質三酰基甘油（triacylglycerol，TAG），蛋白鑲嵌在膜上形成的完整、穩定、獨立存在于細胞質中的膜結構小球體。油脂體主要存在于被子植物中，如蕓苔、花生、芝麻、玉米[1-2]等中；同時也存在于裸子植物如銀杏、蘇鐵屬[3]等中。Huang[4]發現，在原始植物菌類和藻類中也存在油脂體，且含有油脂體的組織能夠抵抗干旱等不良環境，具有長期儲存油脂的能力。但是，有些植物如橄欖、鱷梨等的中果皮，則不能抵抗干旱等不良環境帶來的影響，因為這些組織中的“油脂體”雖然具有與油脂體相同的外形輪廓，但其表面不存在類似油脂體的完整蛋白組成[5]。因此可以說油脂體的表面蛋白對提升油脂體抵抗不良環境的能力具有重要作用。

近年來，關于油脂體的研究不斷增加，這主要是基于油脂體潛在的利用價值。油脂體能作為乳狀液應用于食品、護膚品、洗護用品等中，如冰淇淋、果汁等[6-7]，添加了油脂體的果汁口感更濃厚，且能夠阻止固形物的沉淀；而冰淇淋中添加油脂體則可以去除乳化過程，同時減少非脂乳固體的添加，這可以有效降低冰淇淋的制作成本。目前油脂體蛋白主要用于生物技術研究中，如采用油體蛋白作為融合蛋白，在B. carinata中表達成具有消除Cd2+作用的蛋白[8]。

油脂體因其獨特的易提取、穩定的性能，較適用于食品、醫藥、護膚品等行業，并對行業的發展具有重要意義。

1 油脂體的組成

通過電子顯微鏡觀察發現，成熟種子中的油脂體通常呈球形，當油脂體被分離出后，仍然以球體形式存在[9]，不同種子中的油脂體直徑從0.2～2.5μm不等，這可能是植物生長過程中不同的營養條件和環境因素影響的結果。而在同種種子中，油脂體在不同組織中的大小也不盡相同。例如，在玉米胚芽中，種子子葉中的油脂體比胚軸中的大[4]。油脂體的大小和形狀主要由油與蛋白的比例決定，在玉米種子中，高油和低油品種的玉米其油脂體的形狀、大小不同。種子中油/蛋白比例越高，油脂體越大，呈球形；油/蛋白比例越低，油脂體越小，呈不規則狀。

Tzen[9]和Slack[10]等通過多次離心分離獲得比較純的油脂體，測定其含有92%～98%的中性脂質，1%～4%的磷脂，1%～4%的蛋白。其中，中性脂質大部分是TAG，還有少量的甘油二酯和游離脂肪酸。但油脂體中游離脂肪酸的量可能會改變。Huang[4]研究發現，長時間儲存的種子，其游離脂肪酸含量會增加，這主要是由磷脂和三酰基甘油水解而成的。磷脂主要是卵磷脂，還有少量的磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇；蛋白質大多是油體蛋白，還有少量油體鈣蛋白和甾醇蛋白。此外，還發現了細胞色素c還原酶、脂肪酶[11]、乙醛酸循環磷脂酶[12]等，這些酶在種子萌發時分解油脂體中的脂質，為種子提供能量，以完成種子的萌發過程或幫助種子度過不良環境。

2 油脂體的結構

通過早期的研究知道，油脂體主要是由三酰基甘油、磷脂和蛋白組成；此外，油脂體不論是在體內或體外都保持著穩定性，即在外界環境及油脂體自身結構不發生變化的前提下不發生聚集、融合等現象，能較好地溶解于水中。1992年，Tzen等[9]通過酶解實驗發現，經胰蛋白酶酶解的油脂體穩定性被破壞，發生了聚集等不良反應，Tzen等[13]采用胰蛋白酶酶解油脂體得到了同樣的結果。而用磷脂酶A2或C處理的油脂體仍然保持較好的穩定性；若先用胰蛋白酶處理油脂體再加入磷脂酶則發現磷脂被水解，油脂體發生了融合。實驗結果表明，油脂體是以三酰基甘油為基質，一層磷脂層包圍三酰基甘油，蛋白鑲嵌在油脂體表面的小球體。Tzen等[9]首先得出了油脂體的結構圖，Hsieh等[14]對油脂體結構圖進行了完善，見圖1。Huang[4]分析油脂體認為，一個油脂體單位是由13個磷脂分子和1個油體蛋白分子組成，油脂體的結構單位如圖2所示。

圖1 油脂體結構圖[[1144]]Fig.1 Structural model of oil body[14]

圖2 油脂體結構單位圖[[44]]Fig.2 Surface view of a structural unit[4]

植物細胞中的油脂體具有極佳的穩定性，即使從植物組織中提取出來仍然保持良好的穩定性。Huang[4]認為維持油脂體穩定性的原因主要有兩點：負電性和空間阻力，油脂體表面的蛋白、磷脂等相互作用，形成了緊密、穩定的帶電層，阻止油脂體之間相互作用發生聚集；油脂體表面的蛋白，其空間結構也在一定程度上阻止了油脂體的相互作用，從而維持油脂體的穩定性。由此可見，油脂體中的蛋白對維持油脂體的穩定性起決定性作用。

3 油脂體蛋白

3.1 油脂體蛋白的種類及基本性質

油脂體表面含有多種不同的蛋白，為維持油脂體的個體完整和穩定起到了重要作用。油脂體蛋白中較早被關注的是油體蛋白。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）[15]和免疫細胞化學實驗得知，油脂體蛋白是一種低分子質量的堿性蛋白[16]，且僅存在于油脂體中。油脂體蛋白是被子植物油脂體中含量最豐富的蛋白，并對油脂體的穩定、抗氧化等起到重要作用，因此，對油脂體蛋白的研究及發現都較早、較成熟。除油體蛋白外，Chen等[17]從大米油脂體中還發現了3種新的蛋白Sop1～3，因Sop1的DNA序列與大米中的一種與鈣結合蛋白相同[18]，Sop2與甾醇結合，故將其分別命名為油體鈣蛋白（caleosin）[19]和甾醇蛋白[20]。Lin等[20]分析Sop3的結構發現，其可能是一種能與甾醇結合的類似Sop2的蛋白，通過聚合酶鏈式反應（ploymerase chain reaction，PCR）技術獲得了Sop3的cDNA克隆基因，并在大腸桿菌中進行免疫識別抗體實驗得到證實。因此將Sop2和Sop3分別命名為甾醇蛋白A和甾醇蛋白B。

總結目前對油脂體蛋白的研究，將油脂體蛋白分為3個種類：油體蛋白（15 kD，稱為H-油體蛋白，17 kD，稱為L-油體蛋白）[21]、油體鈣蛋白（27 kD）和甾醇蛋白（39、41 kD，即甾醇蛋白A、B）。H-油體蛋白和L-油體蛋白都存在于被子植物中，但僅L-油體蛋白存在于裸子植物中；油體鈣蛋白不僅存在于高等植物中，原始物種藻類和菌類中也有發現[22]。早期的研究認為油體蛋白是油脂體中最主要的蛋白，維持油脂體的穩定性。而油體鈣蛋白則是一種少數蛋白，與油體蛋白共同存在于花粉、種子的油脂體中，對維持油脂體的功能特性起輔助作用。但新的研究發現在許多原始物種如藻類、菌類、蘇鐵等植物中油體鈣蛋白是主要蛋白，且不存在油體蛋白。也就是說，油體蛋白和油體鈣蛋白均可以作為主要結構蛋白維持油脂體的穩定性，但二者存在的植物種類不同。Jiang等[3]通過文獻檢索發現能編碼油體鈣蛋白而不能編碼油體蛋白的基因大多存在于原始物種中，且二者都能作為主要結構蛋白存在維持油脂體的完整性、穩定性，由此Jiang等認為油體蛋白可能是油體鈣蛋白長期進化而來，此外，Lin等[23]認為油體鈣蛋白是油脂體蛋白中最原始的蛋白，但二者之間的聯系與區別還有待實驗論證。

3.2 油脂體蛋白質的結構及異同點

目前發現的油脂體中的蛋白包括油體蛋白、油體鈣蛋白和甾醇蛋白，前兩者包含3個結構區域，即N端、C端和中部區，甾醇蛋白僅含有N端和C端。

以油體蛋白為例：1）N端，是由40～60個氨基酸組成的兩親區域，其二級結構目前還不清楚。根據其疏水和親水殘基的分布，Huang[4]認為N端大部分的區域與油脂體的表面性質有關。2）中部，是由68～74個氨基酸組成的疏水區，這可能是所有有機體中發現的最長的疏水序列。該區域的二級結構目前存在2種觀點，反相平行的α-螺旋[24]和β-折疊[25]。兩個實驗室分別采用圓二色譜和傅里葉變換紅外光譜，模擬油脂體自然環境的條件，測定油脂體蛋白的中部疏水區的二級結構。測定結果，一個顯示是α-螺旋結構[26]，另一個是β-折疊結構[20]。近來也有研究表明，用同步輻射圓二色性（synchrotron radiation circular dichroism，SRCD）測定蛋白二級結構時，若以SDS為處理液，則油體鈣蛋白主要以α-螺旋結構存在，若以Amphipols為處理液，則主要以β-折疊結構存在，這主要是由于α-螺旋和β-折疊之間可相互轉換[27]。因此我們認為這可能就是中部疏水區二級結構測定結果不一的原因。DNA測序分析發現不同植物組織中，油脂體蛋白在中部疏水區的氨基酸序列相似度非常高，而在這個區域中，12～14個氨基酸殘基的相似度更高，即中部疏水區的Proline Knot結構[4]，保守區序列對蛋白的功能性質起決定性作用。3）C端，是由33～40個氨基酸組成的兩親區，其二級結構為α-螺旋。不同種類油脂體中的油體蛋白都含有以上3個結構區域，分子質量總和為15 kD，但油體蛋白的分子質量區別很大，從15～26 kD不等[4,28-29]，其分子質量超過15 kD的部分會延伸到N端和C端[4]。也就是說，油體蛋白的分子質量區別主要在于N端和C端，延伸到C端的序列具有兩親性，N端的目前還不清楚。延伸區的靈活性較強，因此它對蛋白質的功能影響較小，但是對蛋白質的空間結構起到了一定作用，增加了位阻效應，有利于防止油脂體的聚集，對維持油脂體的穩定起到一定的作用。

油體鈣蛋白的N端也是親水的，但不同于油體蛋白的是它含有一個單獨的與鈣結合的手型EF[30]，鈣能增強油體鈣蛋白的溶解性和表面特性[31]，Chen等[32]發現單子葉植物油脂體中的油體鈣蛋白的N端較雙子葉植物長40～70個殘基。C端也是親水的[23]，且含有4個磷酸結合位點（12 kD）[33-34]，其N端和C端分別是油體蛋白的3倍，但中部疏水區較小，由一個α-螺旋和短錨組成。甾醇蛋白僅含有N端疏水區和C端親水區，N端有2個α-螺旋結構，親水區含有還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）[34]結合子域和甾醇結合子域[35]。甾醇蛋白A、B在結構上的區別是甾醇結合子域的大小不同，脫氫酶活性檢測發現，甾醇蛋白B可能擁有更大、選擇性更高的NADPH。3種蛋白的簡易結構見圖3[36]。

圖3 3 種油脂體蛋白的二級結構簡圖[[3366]]Fig.3 Secondary structures of oleosin, caleosin, and steroleosin[36]

在油體蛋白中，中部疏水區是插入磷脂層中的，而在油體鈣蛋白中，中部區僅短錨結構存在于磷脂層，而短錨結構比油體蛋白中部疏水區小，導致油體鈣蛋白不及油體蛋白穩定[18]。這可能是因為插入磷脂層中的部分越大，與磷脂層及油脂之間的作用力越大，有利于蛋白穩定的吸附在油脂體表面。油脂體蛋白中最重要的結構是疏水區，3種蛋白中僅甾醇蛋白的疏水區存在于N端，其他都在中部區。此外，3種蛋白的保守區也有很大差別，在油體蛋白中是Proline Knot結構，油體鈣蛋白中是Dx[D/N]xDG-鈣結合區，甾醇蛋白中是Proline Knob結構[35]。Abell等[37]研究發現失去保守區“Proline Knot”結構的油體蛋白多肽在運輸過程中失去了其自身的穩定性，無法形成正常的油脂體，即保守區對蛋白的功能特性起決定性作用。甾醇蛋白的N端含有自由的蛋氨酸，而油體蛋白和油體鈣蛋白的N端都發生了乙酰化，形成了封鎖的結構，這樣有利于提高抵抗熱的穩定性，并且能阻止泛素化反應[21]，泛素是一種小蛋白，它的主要功能是標記需要分解的蛋白，使其被水解。而N端乙酰化后，阻止了泛素化反應，從而保護它們不被降解，提高油脂體抵抗熱的穩定性，起到長期儲存油脂的作用。

油脂體中的3種蛋白質在結構上雖然存在很多不同，但歸納來看，3種蛋白質的保守區都是決定蛋白質功能特性的決定因素，如蛋白質的穩定性、酶識別位點等，而N、C端的兩親區域則對油脂體的兩親性起到重要作用，同時為油脂體間提供空間位阻，為防止油脂體的聚集起到一定的積極作用。

3.3 油脂體蛋白的功能

油脂體蛋白對油脂體的穩定、代謝、合成等起到十分重要的作用。穩定的油脂體在胰蛋白酶的作用下失去了穩定性，而在磷脂酶的作用下，仍具有穩定性[9]，這說明蛋白的存在能夠保持油脂體的穩定性。而蛋白能維持油脂體穩定的原因，Huang[4]認為是蛋白的負電性和空間位阻。

負電性：油脂體表面的油體蛋白、磷脂、少量游離脂肪酸和三酰基甘油之間相互作用，形成了一個緊密、穩定的帶電層。分子內的磷脂和油體蛋白之間的相互作用決定了油脂體的帶電性和極性分布。帶正電的油體蛋白與表面帶負電的磷脂和游離脂肪酸相互作用，維持油脂體的穩定性。

空間位阻：油脂體在pH 7.0時帶負電，負電性的油脂體通過靜電斥力阻止了聚集和聚合。調節油脂體溶液的pH 7.0～6.5時，發生了聚集，但是并未發生聚合，這可能是蛋白質空間位阻作用的結果，Tzen等[9]的酶解實驗則更明確地說明油體蛋白的存在阻止了油脂體間磷脂的相互作用，即蛋白質的結構（主要是N端和C端）提供了一定的空間位阻，阻止了油脂體之間發生聚集、聚合等現象。

油脂體中的蛋白不僅對維持油脂體的穩定具有重要作用，而且對種子的合成也有影響。在酵母菌中表達的擬南芥油體鈣蛋白具有氧化還原酶活性，而鈣的存在對環化酶活性具有重要影響[38]，因此，油體鈣蛋白可能與植物的生物合成有關。與油體蛋白直接結合油脂體不同，油體鈣蛋白首先在內膜中形成小囊泡，迅速地移動到油脂體表面與之結合[22]，鈣離子在整個過程中起著調節油體鈣蛋白表面性質和聚集性的作用[31]。

此外，油脂體蛋白上還含有脂肪酶、乙醛酸循環酶[39]等的結合位點，是脂肪酶的激活劑，從而為油脂體的代謝起作用，為種子萌發提供能量[40]。Purkrtova等[31]發現油體蛋白缺失型擬南芥種子胚芽中的油脂體呈不規則狀，且種子萌發緩慢。Poxleitner等[41]研究了油體鈣蛋白缺失型油脂體對種子萌發的影響，發現兩種缺失型種子，其萌發率雖未受影響，但萌發速率遠低于野生型。此外，Schmidt等[42]通過RNA干擾（RNAi）技術干擾種子中油脂體的油體蛋白表達，與野生型對照，油體蛋白缺失型種子生長明顯慢于野生型（圖4）。

圖4 野生型和油體蛋白RNAi型種子7 d后的生長狀況[[4422]]Fig.4 Growth status of wild-type germinated seeds and germinated seeds with 24-kD oleosin knockdown after seven days[42]

由此推斷油體蛋白和油體鈣蛋白都對脂肪酶等脂代謝酶類起激活作用，從而保證種子在萌發過程中有能量來源，當油體鈣蛋白或油體蛋白缺失時，僅油體蛋白或油體鈣蛋白起作用，因此降低了TAG的代謝速率，從而延緩了能量供給，導致種子萌發緩慢。同時也表明油脂體蛋白質具有維持油脂體抵抗不良環境的能力，從而提高植物的生存能力。

對人工合成油脂體進行研究發現，以油體鈣蛋白作為合成底物的油脂體粒徑較油體蛋白的小，熱穩定性也更高[43]。Pei等[44]以油體鈣蛋白、磷脂和中性脂質人工合成油脂體，得到了同樣的結果；結合二者的結構特征推測，即油體鈣蛋白是更為原始的蛋白。兩者之間存在矛盾，即油體鈣蛋白具有更強的維持油脂體穩定的能力，但是按自然選擇學說，生物體應該是向有利的方向變異、進化的，若油體蛋白維持油脂體完整、穩定的能力不如油體鈣蛋白，說明這種進化、演變并不是向有利的方向發展。導致這種矛盾產生的原因可能是，油體蛋白可能具有絕對優于油體鈣蛋白的其他作用，從而使得油脂體最終選擇油體蛋白而非油體鈣蛋白作為其主要結構功能蛋白質。

4 油脂體及油脂體蛋白的提取

油脂體的提取方法主要有：化學試劑提取法和水提取法，兩種方法的基本步驟類似，不同之處在于提取劑的使用。以水提取法為例：將含油脂體的植物原材料（如玉米、大豆、花生等），加入5倍水（m/V），調節pH 9.0，1 200 r/min攪拌24 h，打漿，過濾。調節濾液的pH 5.0、3 800×g離心30 min，浮層即為粗油脂體。對粗油脂體進行水洗離心2次或多次，以得到純度較高的油脂體。化學試劑提取法采用的則是不同的緩沖液，如50 mmol/L的三羥甲基氨基甲烷（tris aminomethane，Tris）-HCl加0.4 mol/L果糖以及0.5 mol/L氯化鈉緩沖液[45]，也有的采用0.1 mol/L Tris-HCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）緩沖液[46]，而提純油脂體所使用的試劑也不同，有吐溫-20[30]，離液劑（主要是尿素、硫脲等）[30]和聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）[23]等。水提取法的優點是安全性高，沒有添加化學試劑等，因此適合于加工生產，食用性強。化學試劑提取法的優點則是純度高、產量高，但極可能殘留化學試劑，因此一般用于實驗研究。

油脂體蛋白的提取：以尿素、硫脲、SDS、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）等制備緩沖液，油脂體與緩沖液按1∶2比例配制，4℃保溫1 h。然后轉移至Tris-HCl（pH 7.4）、Triton X-100、抗壞血酸、DTT、不溶性聚乙烯吡咯烷酮（polyvingypyrrolidone，PVPP）、蛋白酶抑制劑配制的緩沖液中，于4℃條件下提取6 h，10 000×g離心30 min。取上清液，加入三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、DTT、丙酮，-20℃過夜，沉淀用丙酮洗3次，每次15 min即得油脂體蛋白[47]。

5 結 語

近年來，對油脂體的關注度不斷提高，這主要是由于油脂體潛在的利用價值。目前，油脂體中的蛋白質已經被大量運用于生物技術[48-49]中；此外，油脂體還具有應用于食品、藥品、化妝品、個人洗化用品[6,50]等中的潛在價值。但是對油脂體的應用及油脂體自身還存在許多未解決的問題，如油脂體的工業化生產應用還有待研究；油脂體蛋白的二級結構目前還存在爭議；油體蛋白質、油體鈣蛋白質的區別與聯系也有待進一步的研究，這將有利于探討油脂體獨特的生理功能。關于油體鈣蛋白的手型EF以及甾醇蛋白的功能，目前研究的也相對較少。總之，油脂體具有非常高的潛在利用價值，而對油脂體進一步的研究將有利于推動油脂體多方面的應用，促進各行業的發展。

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Review of Research on Components, Structure and Proteins of Oil Body

HU Qi, GUO Shiwen, L? Ying, SHI Xiaodi, GUO Shuntang*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Oil body is an important oil storage organ that contains a matrix of triacylglycerol surrounded by a layer of phospholipid with proteins inserted in it. Proteins in oil body have great effect on maintaining oil body as individual entities and activating related enzymes on the surface of oil body during seed germination, which can be helpful for accelerating metabolism and providing energy, thus promoting the growth of plants. This article systematically states the components, structure of oil body, and the functions and structure of oil body proteins in order to provide a theoretical reference for the industrial application of oil body.

oil body; oleosin; caleosin; steroleosin

S38

1002-6630（2015）11-0230-06

10.7506/spkx1002-6630-201511043

2014-07-11

“十二五”農村領域國家科技計劃項目（2013AA102208）

胡琪（1990—），女，碩士，主要從事食品加工研究。E-mail：Nicole1010796405@163.com

*通信作者：郭順堂（1962—），男，教授，博士，主要從事蛋白質加工與利用研究。E-mail：shuntang@cau.edu.cn