混合血樣DNA等位基因分型探究

龍 兵，羅 楊，門 放

（1.四川警察學(xué)院 四川瀘州 646000；2.瀘州市公安局 四川瀘州 646000）

混合血樣DNA等位基因分型探究

龍 兵1，羅 楊2，門 放1

（1.四川警察學(xué)院 四川瀘州 646000；2.瀘州市公安局 四川瀘州 646000）

以人體混合血樣為研究對象，研究兩個體混合血樣的基因座等位基因分型表現(xiàn)。實驗材料與方法∶采用Chelex-100法提取DNA，ID試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，AB-3130基因自動分析儀電泳，Genemapper3.2軟件進(jìn)行分析。實驗結(jié)果∶兩個體混合血樣的基因座等位基因可表現(xiàn)為4個等位基因，3個等位基因，2個等位基因或1個等位基因。隨著混合比例差距的增大，量少個體的等位基因峰相對于量多個體等位基因峰越來越低。當(dāng)混合比例達(dá)到1∶10時，量少個體的等位基因峰很低，基本上不影響量多個體的等位基因分型。

混合樣本；DNA；STR；等位基因

DNA分析已經(jīng)成為公安工作中進(jìn)行個體識別的重要技術(shù)，在案件的偵破和審判中發(fā)揮重要作用。對于一些特殊檢材的分析，比如混合樣本的分析就是目前DNA分析的一個難點[1][2]?；旌蠙z材是指被測樣本來自兩個或兩個以上個體,常見于陰道拭子、乳頭拭子、皮膚咬痕、致傷多人的兇器、指甲等[3]，是檢案中經(jīng)常遇到的檢材。對于此類檢材，我們常感到十分棘手，難以進(jìn)行確切的個體識別，嚴(yán)重影響此類案件的偵破和審判[4]。本文主要討論了兩個體混合血樣的基因座等位基因分型表現(xiàn)。

一、材料與方法

（一）樣本及DNA提取。

采取4名個體靜脈血樣，標(biāo)記為1，2，3，4號個體。將1號個體與2號個體血樣分別按照1:1，1: 2，1:10，1:50體積混合；3號與4號個體血樣按照同樣方法進(jìn)行混合。對所用檢測樣本均采用Chelex-100法提取DNA[5]，提取的血量為8ul。

（二）PCR擴(kuò)增。

采用AB公司ID試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10ul。AB公司9700 PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性11min，94℃變性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min，共進(jìn)行28個循環(huán)，60℃保溫60min。

（三）電泳檢測及分析。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用AB公司3130基因自動分析儀電泳，Genemapper3.2軟件進(jìn)行分析。電泳體系為：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1ul，去離子甲酰胺10ul,GS500LIZ內(nèi)標(biāo)1.25ul。

二、結(jié)果

當(dāng)按照1：1體積進(jìn)行混合時，DNA圖譜中兩名個體的等位基因峰高比較均衡,如圖1(1號、2號個體STR分型結(jié)果見表1、表2)。當(dāng)混合體積為1：2時，量少個體等位基因峰高比較明顯低于量多個體。隨著混合比例的增大，量少個體等位基因峰相對于量多個體等位基因峰越來越低。當(dāng)混合比例達(dá)到1：10時，量少個體等位基因峰很低，基本上不影響量多個體的等位基因分型（如圖2）。兩個體混合樣本等位基因可表現(xiàn)為4個等位基因（如圖3），3個等位基因（如圖4、5），2個等位基因（如圖6）或1個等位基因（如圖7）。

表一 1號個體STR分型結(jié)果

表二 2號個體STR分型結(jié)果

圖一 1號與2號個體1：1體積混合血樣STR分型圖譜

圖二 1號與2號個體1：10體積混合血樣STR分型圖譜

圖三 1號與2號個體混合樣本D8S1179基因座分型結(jié)果

圖四 1號與2號個體混合樣本TH01基因座分型結(jié)果

圖五 1號與2號個體混合樣本D3S317基因座分型結(jié)果

圖六 1號與2號個體混合樣本D3S1358基因座分型結(jié)果

圖七 1號與2號個體混合樣本TPOX基因座分型為8

三、討論

混合樣本檢測是法醫(yī)DNA分析的難點。尤其是隨著混合個體的數(shù)量的增加，分析顯得尤為困難。本實驗探討了兩個體混合樣本的STR基因座等位基因分型圖譜。兩樣本混合STR圖譜與該兩個個體STR等位基因基因型情況密切相關(guān)。人體細(xì)胞核DNA為二倍體，一名個體STR等位基因最多為兩種（雜合子為兩個不同的等位基因，純合子為兩個相同的等位基因）。兩個體混合樣本的單個STR分型可能表現(xiàn)為四種情況：4個等位基因，3個等位基因，2個等位基因，1個等位基因。本次研究的1號與2號個體混合血樣DNA分析的D8S1179、D21S11基因座表現(xiàn)為4個等位基因（1號、2號個體STR分型結(jié)果見表1、表2）；TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA、D18S51、FGA基因座表現(xiàn)為3個等位基因；D7S820、CSF1PO、D3S1358、D5S818基因座表現(xiàn)為2個等位基因；TPOX基因座表現(xiàn)為1個等位基因。

當(dāng)混合樣本DNA分析基因座表現(xiàn)為4個等位基因時，兩名個體均為雜合子，如果我們已知一名個體的分型，容易推斷另外一名個體的分型，當(dāng)混合比例達(dá)到1：10時，我們從圖譜上能夠比較容易區(qū)分兩名個體的基因座等位基因分型，如本次研究的D8S1179基因座（如圖3），1號個體基因型為13-15，2號個體基因型為10-14，從1：10混合血樣圖譜上我們能夠清晰的進(jìn)行區(qū)分。

當(dāng)混合樣本DNA分析基因座表現(xiàn)為3個等位基因時，個體的等位基因組合就比較多，兩名個體可能一名為純合子，一名為雜合子，也可能兩名個體均為雜合子，如本次研究的TH01基因座一名個體為純合子（9-9），一名個體為雜合子（6-7），當(dāng)混合比例達(dá)到1：10時，含量少的個體（9-9）分型峰很低（如圖4）。混合樣本D13S317基因座分型圖譜表現(xiàn)為3個等位基因，兩名個體均為純合子（10-11，11-12），隨著混合比例的增加，等位基因10的相對峰高逐漸降低（如圖5）。

當(dāng)混合樣本DNA分析基因座表現(xiàn)為2個等位基因時，兩名個體可能都為純合子，可能一個純合子與一個雜合子，可能兩個都為雜合子。如本次研究的D3S1358基因座一名個體為雜合子（15-16）另一名個體為純合子（16-16），隨著混合比例的增加，等位基因15的相對峰高逐漸降低（如圖6）。

當(dāng)混合樣本DNA分析基因座表現(xiàn)為1個等位基因時，則兩名個體為相同的純合子，如本次研究的TPOX基因座兩名個體均為純合子（8-8）（如圖7）。

混合樣本是法醫(yī)DNA分析的一個難點問題，我們只是對兩樣本混合的情況進(jìn)行了等位基因分型的初步研究，如何區(qū)分混合樣本中各個個體的基因型將是一個長期研究的課題。

[參考文獻(xiàn)]：

[1]呂德堅，陸惠玲，陳玉川.混合斑的DNA分型解析[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2002，18（3）:185-188.

[2]Bill,P.Gill,J.Curran,T.Clayton,R.Pinchin,M.Healy,J.Buckleton,PENDULUM-a guideline based approach to the interpretation of STR m ixtures,Forensic Sci.Int.148(2004)181-189.

[3][美]布爾特爾.法醫(yī)DNA分型∶STR遺傳標(biāo)記的生物學(xué),方法學(xué)及遺傳學(xué)[M].侯一平.劉雅誠譯，北京∶科學(xué)出版社，2007.

[4]T.M.C layton,J.P.W hitaker,R.L.Sparkes,P.Gill,Analysis and intepretation ofm ixed forensic stains using DNA STR profiling,Forensic Sci.Int.91(1998)55-70.

[5]P.S.W alsh,D.A.Metzger,R.Higuchi,Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based from forensicmaterial,Biotechniques10(1991)506-513.

Exp loration on Allelic Classification of Mixed Blood DNA

LONG Bin,LUO Yang,MENG Fang

Target:Research on allelic classification performance of gene locus in two mixed human blood.Materials and Methods:using Chelex-100 to extract DNA,amplifying PCR in ID kit,making analysis by AB-3130 gene electrophoresis automatic analyzer and Genemapper3.2 software.Results:4 or 3 or 2 or 1 alleles can be showed in twomixed blood gene locus.With the increasing ofmixture ratio,the allele peak with less amounts becomes lower and lower than those with more amounts.When mixing proportion reaches 1:10,allele peak is lowest,basically does notaffectallelic classification in large amounts

Mixed Samples;DNA;STR;Allele

D919.2

：A

：1674-5612（2015）01-0051-06

（責(zé)任編輯：吳良培）

2014-07-11

龍 兵，(1980-)，男，四川德陽人，四川警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系副教授，研究方向：法醫(yī)遺傳學(xué)。