異甘草素保護創傷性腦損傷大鼠神經功能的實驗研究*

杜 靚 金巧萍

（浙江省金華市中心醫院，浙江 金華 321000）

·研究報告·

異甘草素保護創傷性腦損傷大鼠神經功能的實驗研究*

杜 靚 金巧萍

（浙江省金華市中心醫院，浙江 金華 321000）

目的觀察異甘草素對創傷性腦損傷大鼠神經功能的影響。方法先對大鼠建立腦損傷模型，按隨機數字表法隨機分成假手術組、腦損傷組、異甘草素組，假手術組、腦損傷組予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，異甘草素組予20 mg/kg藥物灌胃治療，1周后處死，均終點法檢測過氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、酶聯免疫吸附法測白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，觀察在以上指標變化情況。結果異甘草素組SOD、MDA、Feeney評分、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10分別為（123.77±9.35）U/mg、（3.27±1.15）U/mg、（2.12±0.43）分、（38.74±2.35）pg/mg、（106.24±9.13）pg/mg、（83.46±7.24）pg/mg、（367.69±36.13）pg/mg、（417.35± 25.35）pg/mg，和其他兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；在組織形態學上，表現為腦皮層損傷灶細胞數明顯增多，傷口肉芽組織填平，軟腦膜已經形成，且和正常腦組織入腦膜相續，半透明水腫帶交窄，水腫帶局限在損傷灶底部，與其他組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論異甘草素能保護創傷性腦損傷大鼠神經功能，可能和降低氧化應激和調節腦組織細胞因子有關。

異甘草素 創傷性腦損傷 大鼠 神經功能

創傷性腦損傷是由于外力作用下引起腦組織原發性/繼發性損傷，從而造成腦組織發生一系列病理生理代謝紊亂和功能失調。在臨床上，如何阻斷和減輕繼發性損害是一個難點。現代藥理學認為甘草在腦保護上有廣泛藥理活性［1］。本研究就通過觀察異甘草素保護創傷性腦損傷大鼠神經功能情況，以期選擇最佳治療方法，提高臨床診治水平。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 隨機選取36只大鼠為研究對象，分為3組，每組12只，均為雄性，平均體質量為（150± 15）g，均購自復旦大學實驗動物中心，合格證編號為20140412B。異甘草素（純度為98%）由上海生物科技有限公司提供；過氧化物歧化酶 （SOD）、丙二醛（MDA），酶聯免疫吸附法白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒均由日本三洋公司提供。低速離心機、超低溫冰箱等均由上海實業有限公司提供。

1.2 動物分組和模型制備 大鼠按隨機數字表法隨機分成假手術組、腦外傷組、異甘草素組，每組均為12只。腦外傷組及異甘草素組先進行模型制備，造模參考文獻［2］的方法進行，自制打擊器、由撞桿、下落打擊棒和金屬套等組成，質量為30 g，麻醉小鼠后，固定頭部后矢狀正中線切開頭皮，打擊大鼠頭部造成左大腦半球局部腦挫傷損傷后，充分止血后用碘伏消毒清洗傷口并縫合頭皮。假手術組則僅開窗不進行打擊，以大鼠短暫四肢抽搐，呼吸暫停為造模成功。

1.3 干預方法 異甘草組小鼠于術后2 h腹腔注射異甘草素30 mg/kg，每日1次，腦外傷組同時腹腔注射等量蒸餾水，每日1次，共治療6 d。

1.4 檢測方法 治療后每只經10%水合氯醛2 mL腹腔注射。麻醉后迅速斷頭取腦，用冰冷生理鹽水沖洗腦組織表面血跡，濾去殘余水分，取大鼠腦組織約0.2 mL，同時用電子天平測量質量后加入10倍體積PBS緩沖液損傷大腦皮層勻漿，離心后取上層清液說明書步驟進行腦組織勻漿SOD、MDA、TNF-α檢測，檢測腦組織細胞因子白介素-1α（IL-1α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）水平。并將大鼠置于平衡木行走試驗，測定運動整合和協調能力，按照Feeney計分標準計分。

1.5 病理切片觀察損傷灶組織形態 腦組織切片石蠟包埋制片，HE染色顯微鏡下放大50倍觀察腦組織和損傷病灶組織形態學病理變化，病例切片方法參考文獻［3］。

1.6 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能指標比較 見表1。對各組神經功能指標進行比較，假手術組和腦外傷組、假手術組和異甘草素組、假手術組和異甘草素組在SOD、MDA、Feeney評分、TNF-α比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經功能指標比較（±s）

表1 各組大鼠神經功能指標比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.05；與腦外傷組比較，△P＜0.05。下同。

組別 n S O D（U / m g） M D A（n m o l / m g）F e e n e y評分（分）T N F -α（p g / m g）假手術組 1 2腦外傷組 1 2 1 1 8 . 5 7 ± 7 . 2 4 2 . 0 3 ± 0 . 5 8 0 . 3 4 ± 0 . 1 3 2 0 . 3 6 ± 2 . 1 4 1 0 1 . 3 4 ± 7 . 2 3*4 . 1 8 ± 1 . 2 7*4 . 1 1 ± 0 . 5 6*4 5 . 4 6 ± 4 . 1 3*異甘草素組 1 2 1 2 3 . 7 7 ± 9 . 3 5*△3 . 2 7 ± 1 . 1 5*△2 . 1 2 ± 0 . 4 3*△3 8 . 7 4 ± 2 . 3 5*△

2.2 各組大鼠腦皮層組織形態學比較 見圖1～圖3。假手術組腦皮層細胞均勻，細胞密集，軟腦膜連續且完整；腦外傷組腦皮層打擊形成腦軟化灶，創面凹陷，細胞數目稀疏，半透明水腫帶超出損傷灶延伸至海馬；異甘草素組腦皮層損傷灶細胞數明顯增多，傷口肉芽組織填平，軟腦膜已經形成，且和正常腦組織入腦膜相續，半透明水腫帶交窄，水腫帶局限在損傷灶底部。

圖1 假手術組

圖2 腦外傷組

圖3 異甘草素組

2.3 各組大鼠細胞因子指標比較 見表2。對各組細胞因子進行比較，假手術組和腦外傷組、假手術組和異甘草素素組、假手術組和異甘草素素組在IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠細胞因子指標比較（pg/mg，±s）

表2 各組大鼠細胞因子指標比較（pg/mg，±s）

組別 n I L -1 α I L -1 β I L -6 I L -1 0假手術組 1 2腦外傷組 1 2 7 3 . 1 3 ± 4 . 5 6 1 0 1 . 3 5 ± 1 1 . 2 7 1 8 7 . 3 5 ± 2 1 . 0 4 3 4 9 . 2 4 ± 2 0 . 1 4 4 7 . 3 4 ± 5 . 3 5*1 4 7 . 7 8 ± 1 3 . 2 1*4 6 7 . 3 6 ± 4 5 . 1 5*3 0 4 . 5 6 ± 2 1 . 3 4*異甘草素組 1 2 1 0 6 . 2 4 ± 9 . 1 3*△8 3 . 4 6 ± 7 . 2 4*△3 6 7 . 6 9 ± 3 6 . 1 3*△4 1 7 . 3 5 ± 2 5 . 3 5*△

3 討 論

腦損傷后氧化應激會加重繼發性腦損傷，創傷性腦損傷后氧化和抗氧化作用失衡，氧自由基會大量失去，這就會造成組織破壞和細胞破壞，而氧化應激會促使細胞直接壞死，誘導凋亡程序啟動，促使細胞凋亡。研究［2］稱，創傷性腦損傷后會產生脂質過氧化，蛋白質氧化等，損傷DNA，造成神經細胞損傷，而SOD、MDA則是反映腦組織氧化應激反應水平良好指標。創傷性腦損傷后，血管壁破壞，血液進入組織間隙，引起血管性腦水腫，損傷區血供減少、細胞缺血引起細胞鈉鉀泵轉運障礙，形成細胞水腫［3］。

中醫學認為，創傷性腦外傷是腦內傷范疇，其病理機制是氣滯血瘀、痰凝和水停，在急性期需手術治療，恢復期則以中醫藥治療為主。創傷性腦外傷后內部脈絡會發生破裂，血溢脈外后積累于局部形成瘀血造成髓海失養，引起五臟六腑失調，陰陽失去平衡。在本次研究中，異甘草素是甘草一種有效成分，具有理氣活血、疏通經脈等作用，現代醫學認為其有護心、護肝、保腦等作用。研究［4］稱，該藥物能減輕創傷性腦損傷大鼠心肌炎心肌酶譜等指標。報道則稱，異甘草素有明顯保護神經作用，能抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡和抗膽堿酯酶、環磷酸腺苷磷酸二脂酶等。現代藥理學認為，此藥有較好的抗氧化活性和減少活性氧作用，能降低CASPAS-3表達，提高組織BACL-2表達，減少鈣離子聚集，保護腦皮層細胞，對神經退變有很好作用，且能調節蛋白質代謝，信號轉導，蛋白質折疊和運輸，能降低可卡因誘導神經元毒性作用保護腦組織［5］。結果顯示，異甘草素能增加創傷性腦外傷SOD活性，減少MDA生成，降低腦組織含水量，且在抑制炎癥因子上也有明顯效果，能促進創面愈合，促進神經元生長和改善神經行為學作用。和報道［6］的稱其組方中的甘草能抑制COX-2等基因表達并抑制MAPK通路激活，對大腦中動脈大鼠具有神經保護作用，能提高SOD、CAT活性，抑制MDA等活性，減少大鼠腦組織缺血再灌注損傷等，和本次研究中結果是一致的，這再次證實了異甘草素在創傷性腦外傷上的效果是顯著有效的，特別是保護神經功能上。

研究［7-8］還稱，異甘草素還具有抗脂質過氧化、松弛血管，能抑制血小板聚集、抗病毒和抗腫瘤，雌激素樣活性和抗細胞凋亡等多種藥理作用，而結果看出，在炎癥因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α上有明顯變化，這是因為該藥物能促進血管通透性，促進氧自由基釋放，且研究［9-10］稱該藥物能明顯抑制小膠質細胞活性，能通過神經元存活，改善神經功能評分。這也再次說明了IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α是進一步激活巨噬細胞活性，會產生炎性代謝物質，維持和加重炎性反應，造成腦組織再次損傷。故在臨床上對創傷性腦損傷要從以上病理機制著手進行處理。

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［4］ 姜拓之，楊永明，荔志云，等.異甘草素對創傷性腦損傷大鼠神經保護作用的實驗研究［J］.創傷外科雜志，2015，1（2）：113-116.

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Isoliquiritigenin Protect Basic Neurological Research Traumatic Brain Injury in Rats

DU jing，JIN Qiaoping.Central Hospital of Jinhua City in Zhejiang Province，Zhejiang，Jinhua 321000，China

Objective:To investigate isoliquiritigenin of traumatic brain injury in rats with nerve function.Methods:First，the establishment of brain injury in rats were randomly divided into sham group，brain injury group，Isoliquiritigenin group，sham operation group，brain injury group were fed with normal saline，Isoliquiritigenin groupⅠ20 mg/kg of drugs gavage treatment.One week after the death，rats were detected by ultra-manifold end peroxidase（SOD），malondialdehyde （MDA），enzyme-linked immunosorbent assay of interleukin（IL-6），tumor necrosis factor（TNF-α）content to observe the changes in these indicators.Results:Isoliquiritigenin group SOD，MDA，IL-6，TNF-α，respectively （123.77±9.35）U/mgprot，（3.27±1.15）U/mgpro，（367.69±36.13）pg/mg，（38.74±2.35）pg/mg，and the other two groups was statistically significant difference（P＜0.05）；in the tissue morphology，the number of tumor cells in the brain showed significantly increased cortical injury，wound granulation tissue filled，pia mater had been formed，and and normal brain tissue into the meninges phase continued，cross narrow translucent edema，edema lesions confined to the bottom of the injury.And other differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion:Isoliquiritigenin can protect nerve injury in rats with traumatic brain function，which may be related to reducing oxidative stress and regulating brain cytokines.

Isoliquiritigenin；Traumatic brain injury；Rat；neurological

285.5

A

1004-745X（2015）08-1362-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.08.018

2015-04-17）

浙江省金華市科技研究計劃重點項目（2013-3-002）